Els viroids són els patògens vegetals coneguts amb menor complexitat biològica.
En els últims anys han sigut descrit com a agents infecciosos d'un gran numere
d'espècies (tant herbàcies com llenyoses) amb interés agronòmic. El seu estudi a banda
de l'interés agre-econòmic que pot reportar, resulta atractiu pel fet que representa el
model més simple per a estudiar les interaccions entre patògens de RNA i els seus
hostes. Com aquesto organismes no posseïxen capacitat descrita per a codificar
proteïnes, totes les fases del seu cicle vital, així com la resposta patogènica induïda
durant la seua infecció, són estrictament dependent de la seua interacció amb factors de
l'hoste. La visió clàssica del procés de patogènesi viroidal assumix que les alteracions
induïdes en la planta durant la infecció són conseqüència de la competència hostepatogen
per factors cel·lulars implicats en la transcripció, el moviment cèl·lula a cèl·lula
i/o el moviment sistèmic del viroid. No obstant això una sèrie de resultats obtinguts en
estudis previs suggerixen que possiblement la resposta de silenciament de RNA de
l'hoste enfront d'estos patògens siga la responsable del procés de patogènesi associada
amb la infecció viroidal. En el present treball s'ha tractat d'estudiar la relació entre el dit
mecanisme de silenciament de RNA i la patogènesi viroidal (en concret del HSVd).
El primer pas, reflectit en el capítol 1 d'esta tesi, va ser el caracteritzar les
alteracions en el desenvolupament induïdes per HSVd en plantes transgèniques de N.
benthamiana. En regla general, l'anàlisi de les alteracions fenotípiques en plantes de N.
benthamiana que expressaven formes dimériques de HSVd va confirmar la seua
similitud amb els símptomes associats a la infecció del viroid en els seus hostes naturals,
justificant en conseqüència emprar el sistema HSVd/Nicotiana benthamiana com a
model per a l'estudi del procés de patogènesi induïda pels viroids nuclears.
Davant de la sèrie de resultats contradictoris que existien en la literatura sobre la
implicació del silenciament de RNA en la patogènesi viroidal, considerem que era
necessari aportar noves evidències que permeteren fer llum sobre esta relació d'una
manera directa, açò és, estudiant la interacció entre components fonamentals de la
maquinària de silenciament de RNA i els viroids. Per a realitzar esta anàlisi (capítol 2)
estudiem 2 variables que afecten el silenciament de RNA: una bioquímica, la RDR6 i
una altra ambiental, la temperatura. Els resultats mostrats en este capítol indiquen que
en la interacció HSVd–N.benthamiana l'expressió de símptomes és un procés
estrictament lligat al silenciament de RNA mediat per RDR6 i totalment independent
dels nivells d'acumulació del patogen en la planta, aportant la primera evidència
experimental directa sobre l'existència d'una estreta relació entre la patogènesi viroidal i
el silenciament de RNA específic de viroids, que havia sigut prèviament suggerida per
diversos autors.
Amb la finalitat d'aprofundir en la biogènesi dels vd-sRNAs, dada que ens oferix
un retrat més exacte sobre que components de la maquinària de silenciament i les
formes precursores del viroid que podrien estar implicats en la producció de vd-sRNAs,
duem a terme un experiment de seqüenciació massiva de vd-sRNAs en dos teixits
diferents de Cucumis sativus (hoste natural per al HSVd), fulla i exsudat floematic.
Estes dades, exposade en el capítol 3, indiquen que els vd-sRNAs s'originen per l'acció
jerarquitzada de diverses DCLs sobre un dsRNA complementari generat a partir d'un
precursor lineal i no de la molècula madura. A més, les dades de la llibreria generada a
partir de sRNAs derivats d'exsudat floematic, indiquen una distribució diferencial de
grandària i seqüència en este teixit.
A pesar de tots els reports existents sobre com diversos patògens afecten el
balanç de miRNAs en la planta, no existien estudis en profunditat dedicats a analitzar en
profunditat com el procés d'infecció viroidal altera els nivells este tipus de RNA
reguladors en l'hoste. Tenint en compte que a més, no havien sigut caracteritzats en esta
espècie, el nostre primer objectiu va ser realitzar un inventari dels sRNAs endògens de
cogombre així com una caracterització dels miRNAs trobats i els seus potencials
precursors (capítol 4). Amb aquesta caracterització, disposàvem d'un marc de referència
per a poder analitzar les alteracions en este grup de ribo-reguladores associades al
procés infecciós induït per HSVd (capítol 5). Els resultats obtinguts ens van permetre
identificar 4 tipus diferents d'alteracions induïdes per HSVd durant la infecció: a)
alteració del perfil general de sRNAs, sent la família de 21 nts la de major acumulació
en planta infectada, b) repressió i sobreexpressió d'un grup de miRNAs, c) expressió
diferencial en planta infectada d'un grup de miRNAs específics de cogombre, i d)
alteració en l'eficiència de processament dels miRNAs de planta infectada en general.
Finalment, concloem amb l'anàlisi bioinformàtica d'un dels aspectes fonamentals de la
hipòtesi de patogènesi viroidal mediada per silenciament de RNA, l'estudi de la
capacitat dels vd-sRNAs de regular l'expressió de gens endògens de la planta. En la seua
gran majoria els potencials targets coincidixen amb gens relacionats amb processos de
desenrotllament, metabolisme de proteïnes, resposta a estrés, regulació de la
transcripció, biogènesi cel·lular, etc. Açò permet especular sobre l'existència d'una
relació directa en la regulació negativa d'alguns d'estos gens mediada pels vd-sRNAs i
els símptomes comunament observats en una planta infectada.