Resumen

Los viroides son pequeños RNAs circulares de cadena sencilla (246-401 nt) patógenos de plantas. A pesar de su pequeño tamaño y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y, en la mayoría de los casos, provocar enfermedades en sus plantas huésped. Al no codificar proteínas propias, la replicación de los viroides depende de la interacción del RNA viroidal con factores del huésped. Esta replicación ocurre a través de un mecanismo de círculo rodante con intermediarios de RNA con tres etapas que, con algunas variaciones, se repiten en las cadenas de ambas polaridades: (1) transcripción RNA-RNA que origina RNAs oligoméricos de polaridad complementaria, (2) procesamiento de algunos de estos oligómeros a monómeros lineales, y (3) circularización de estos últimos. La presente Tesis Doctoral ha tenido como objetivo el estudio de los factores del huésped implicados en la tercera etapa de la replicación viroidal.
Con el fin de identificar los factores celulares implicados en la ligación de los RNAs monoméricos lineales de los viroides nucleares (familia Pospiviroidae), se ensayó la ligación in vitro del RNA monomérico lineal del viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd), abierto por el sitio de procesamiento fisiológico y con extremos 5'-fosfomonoéster (5'-P) y 3'-hidroxilo (3'-OH), en presencia de diferentes fracciones cromatográficas de proteínas de hojas de tomate, huésped experimental de este viroide. Una actividad enzimática capaz de circularizar el RNA viroidal se detectó en las fracciones de la columna de heparina eluidas a concentraciones de KCl en torno a 0.5 M. Esta actividad de ligación resultó ser específica de los extremos del RNA ensayados y por lo tanto diferente de la única RNA ligasa de plantas conocida: la tRNA ligasa, que reconoce extremos 5’-hidroxilo (5'-OH) y 2',3'-fosfodiéster cíclico (2',3'>P). La nueva actividad de tomate es sensible a desnaturalización térmica y degradación proteolítica, requiere Mg2+ y ATP como cofactores, y muestra una alta especificidad de sustrato, ligando exclusivamente el PSTVd lineal abierto por el sitio de procesamiento fisiológico. La actividad cataliza además la circularización de los RNAs monoméricos lineales de los miembros representativos de los otros géneros de la familia Pospiviroidae, todos ellos abiertos por el sitio de procesamiento fisiológico. Empleando [a-32P]ATP en la reacción de ligación se detectó una proteína adenilada de aproximadamente 90 kDa con un comportamiento cromatográfico coincidente con la actividad RNA ligasa. El análisis por espectrometría de masas de una fracción proteica conteniendo esta proteína condujo a concluir que la actividad que circulariza el RNA viroidal reside muy probablemente en la DNA ligasa 1 de tomate. Esta conclusión se confirmó cuando el cDNA correspondiente se clonó y expresó en Escherichia coli, y la proteína resultante se purificó y ensayó in vitro empleándose como sustrato el PSTVd lineal abierto en el sitio de procesamiento fisiológico.
Respecto a los factores del huésped que pudieran estar implicados en la ligación de los intermediarios replicativos de los viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae), recientemente se han identificado isoformas de la tRNA ligasa que, probablemente por un mecanismo de traducción alternativa, contienen un péptido de tránsito al cloroplasto. Esta enzima reconoce específicamente extremos de RNA 5'-OH y 2',3'>P, que son los que produce el autocorte mediado por las ribozimas de cabeza de martillo características de la familia Avsunviroidae. Por esta razón, se clonó el cDNA correspondiente a la isoforma cloroplástica de la tRNA ligasa de berenjena y se expresó en E. coli. Los ensayos de ligación in vitro con la proteína recombinante purificada, empleando como sustrato el RNA monomérico lineal del viroide latente de la berenjena (ELVd) con extremos 5’-OH y 2’,3’>P, mostraron que la misma, en una reacción dependiente de Mg2+ y ATP, cataliza la eficiente circularización del ELVd lineal únicamente cuando éste se encuentra abierto por el sitio de procesamiento fisiológico. La tRNA ligasa de berenjena mostró además capacidad de circularizar los RNAs monoméricos lineales de ambas polaridades de los otros viroides cloroplásticos, poniendo de manifiesto que es muy probablemente el factor del huésped implicado en la última etapa de su replicación.