Resum

Els viroides són menuts RNAs circulars de cadena senzilla (246-401 nt) patògens de  plantes. Malgrat la seua xicoteta grandària i de no codificar proteïnes, són capaços de replicar-se autònomament, moure’s sistèmicament i, en la majoria dels casos, provocar malalties en les seues plantes hoste. Al no codificar proteïnes pròpies, la replicació dels viroides depèn de la interacció de l’RNA viroidal amb factors de l’hoste. Aquesta replicació ocorre a través d’un mecanisme de cercle rodant amb intermediaris d’RNA amb tres etapes que, amb algunes variacions, es repeteixen en les cadenes d’ambdues polaritats: (1) transcripció RNA-RNA que origina RNAs oligomèrics de polaritat complementària, (2) processament d’alguns d’aquests oligòmers a monòmers lineals, i (3) circularització d’aquests últims. La present Tesi Doctoral ha tingut com a objectiu l’estudi dels factors de l’hoste implicats en la tercera etapa de la replicació viroidal.
Amb la finalitat d’identificar els factors cel•lulars implicats en la lligació dels RNAs monomèrics lineals dels viroides nuclears (família Pospiviroidae), es va assajar la lligació in vitro de l’RNA monomèric lineal del viroide del tubèrcul fusiforme de la creïlla (PSTVd), obert pel lloc de processament fisiològic i amb extrems 5'-fosfomonoéster (5'-P) i 3'-hidroxil (3'-OH), en presència de diferents fraccions cromatogràfiques de proteïnes de fulles de tomata, hoste experimental d’aquest viroide. Una activitat enzimàtica capaç de circularitzar l’RNA viroidal es va detectar en les fraccions de la columna d’heparina eluïdes a concentracions de KCl al voltant de 0.5 M. Aquesta activitat de lligació va resultar ser específica dels extrems de l’RNA assajats i per tant diferent de la única RNA lligasa de plantes coneguda: la tRNA lligasa, que reconeix extrems 5’-hidroxil (5'-OH) i 2',3'-fosfodiéster cíclic (2',3'>P). La nova activitat de tomata es sensible a desnaturalització tèrmica i degradació proteolítica, requereix Mg2+ i ATP com a cofactors, i mostra una alta especificitat de sustrat, lligant exclusivament el PSTVd lineal obert pel lloc de processament fisiològic. L’activitat catalitza a més la circularització dels RNAs monomèrics lineals dels membres representatius dels altres gèneres de la família Pospiviroidae, tots ells oberts pel lloc de processament fisiològic. Emprant  [a-32P]ATP en la reacció de lligació es va detectar una proteïna adenilada de aproximadament 90 kDa amb un comportament cromatogràfic que coincideix amb l’activitat RNA lligasa. L’ anàlisi per espectrometria de masses d’una fracció proteïca contenint aquesta proteïna va portar a concloure que la activitat que circularitza el RNA viroidal resideix molt probablement en la DNA lligasa 1 de tomata. Aquesta conclusió es va confirmar quan el cDNA corresponent es va clonar i expressar en Escherichia coli, i la proteïna resultant es va purificar i assajar in vitro emprant-se com a sustrat el PSTVd lineal obert al lloc de processament fisiològic.
Respecte als factors de l’hoste que pogueren estar implicats en la lligació dels intermediaris replicatius dels viroides cloroplàstics (familia Avsunviroidae), recentment s’han identificat isoformes de la tRNA lligasa que, probablement per un mecanisme de traducció alternativa, contenen un pèptid de trànsit al cloroplast. Aquest enzim reconeix específicament extrems d’RNA 5'-OH i 2',3'>P, que són els que produeix l’autotall intervingut per els ribozims de cap de martell característics de la família Avsunviroidae. Per aquesta raó, es va clonar el cDNA corresponent a la isoforma cloroplàstica de la tRNA lligasa d’albergínia i es va expressar en E. coli. Els assajos de lligació in vitro amb la proteïna recombinant purificada, emprant com a sustrat l’RNA monomèric lineal del viroide latent de l’albergínia (ELVd) amb extrems 5’-OH i 2’,3’>P, mostraren que la mateixa, en una reacció depenent de Mg2+ i ATP, catalitza l’eficient circularització de l’ELVd lineal únicament quan aquest es troba obert pel lloc de processament fisiològic. La tRNA lligasa d’alberginia va mostrar a més capacitat de circularitzar els RNAs monomèrics lineals d’ambdues polaritats dels altres viroides cloroplàstics, ficant de manifest que molt probablement es el factor de l’hoste implicat en la última etapa de la seua replicació.