RESUMEN


El uso de plantas como biofactorías se ha propuesto como una opción sencilla, económica y más segura para la producción biotecnológica de proteínas heterólogas y otros productos de aplicación en medicina o industria. Asímismo, los virus de vegetales pueden ser una herramienta muy eficiente para la obtención de dichos productos, gracias a su facilidad natural de infectar, invadir las plantas y expresar su información genética eficientemente. Entre ellos se encuentra el virus del grabado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV), un virus de RNA de cadena positiva de la familia Potyviridae ampliamente empleado en estudios sobre biología molecular de virus de plantas e interacciones planta-patógeno. Basándose en un clon infeccioso de este virus, en el presente estudio se ha desarrollado un vector viral desarmado que permite la expresión simultánea de múltiples proteínas heterólogas en plantas.

Puesto que el único clon infeccioso de este virus disponible era inestable durante su amplificación en bacterias como Escherichia coli, como primera etapa para el desarrollo del vector de expresión, se diseñaron y construyeron tres nuevos plásmidos con el mismo clon infeccioso del TEV que permitieran infectar plantas con RNA transcrito in vitro (pMTEV), directamente con DNA (p35TEV) o por agroinoculación (pGTEV). En su construcción se eliminaron las secuencias consideradas superfluas en los plásmidos correspondientes y se orientaron los distintos elementos funcionales de forma lógica para aumentar la estabilidad del cDNA viral durante su propagación en bacterias. Los tres nuevos plásmidos resultaron mucho más estables que el ancestral y permitieron infectar eficientemente plantas de tabaco mediante RNA transcrito, directamente con DNA plasmídico o por agroinoculación. 

El vector de expresión se construyó sobre la base del plásmido para agroinoculación pGTEV. En el vector, el cistrón viral que codifica la RNA polimerasa RNA dependiente (proteína NIb) se reemplazó por un casete que contenía los cDNAs de las distintas proteínas heterólogas a expresar. Estos cDNAs fueron flanqueados por las secuencias correspondientes a sitios de corte naturales y artificiales de la proteasa viral NIaPro para asegurar el correcto procesamiento de las proteínas heterólogas de la poliproteína viral. Se construyeron varias versiones del vector de expresión, entre las que destacan el vector que expresa tres proteínas fluorescentes, roja (mCherry), amarilla (Venus) y azul (mTagBFP), y el que expresa dos factores de transcripción de Antirrhinum majus (Delila y Rosea1) de la ruta de biosíntesis de las antocianinas. Al inocular plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) transgénicas, que suplementan la función NIb a través de un transgén, se detectó la expresión colocalizada de las tres proteínas fluorescentes tanto a nivel de tejido como subcelular. También se comprobó el eficiente procesamiento de cada proteína heteróloga a partir de la poliproteína viral. Finalmente, se comprobó que el vector que carece del cistrón de su RNA polimerasa es incapaz de infectar plantas en las que esta función no es suplementada, lo que supone un importante elemento de biocontención de la tecnología. En el caso de la expresión de los dos factores de transcripción que activan la biosíntesis de antocianinas, la inoculación de las plantas transgénicas que expresan NIb provocó una fuerte acumulación de estos compuestos en los tejidos infectados por el virus que adquirieron una fuerte coloración rojiza. Estos resultados avalan la utilidad del nuevo vector para expresar proteínas heterooligoméricas que requieren un correcto ensamblado de sus múltiples componentes y en ingeniería metabólica de plantas. 

A continuación, para mejorar los niveles de expresión de las proteínas heterólogas a partir del vector viral basado en el TEV, se analizó el efecto de insertar un segundo supresor viral del silenciamiento inducido por RNA. Los resultados sobre un vector que expresa la proteína fluorescente roja mCherry mostraron que la coexpresión de la proteína P19 del virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV) aumenta la expresión en aproximadamente un 50%, y la proteína 2b del virus del mosaico del pepino (CMV) la aumenta un 20%. En contraste, la proteína 16K del virus del cascabeleo del tabaco (TRV) no tiene ningún efecto, mientras que la proteína HC-Pro de otro potyvirus, el virus de la sharka de los frutales de hueso, tiene un efecto negativo. En una segunda estrategia para mejorar el vector de expresión desarmado basado en el TEV, se estudio qué otros cistrones del genoma del virus podrían transferirse a la planta huésped. Utilizando una estrategia de expresión transitoria en plantas de Nicotiana benthamiana, se identificaron nuevos cistrones que se podrían eliminar del vector y ser suplementados en trans, lo que mejorará la capacidad de albergar información genética heteróloga por parte del vector.

Finalmente, los estudios de expresión de factores de transcripción de la ruta de las antocianinas llevaron al desarrollo de un nuevo sistema para seguir visualmente la dinámica de un proceso de infección viral en plantas. El sistema se basa en la expresión del factor de transcripción Rosea1 (Ros1) de 25.7 kDa que induce la acumulación de antocianinas coloreadas en los tejidos por los que el virus se replica y mueve. La cantidad de pigmento rojo se observó que correlacionaba con la carga viral, por lo que el marcador resultó ser cuantitativo. Además, este marcador mostró ser muy estable durante pases infectivos seriados en plantas de tabaco. Además de la infección del TEV en plantas de tabaco, el marcador mostró ser útil para seguir la infección del potyvirus del mosaico del nabo en plantas de Arabidopsis thaliana y del virus del mosaico del tabaco o el virus X de la patata en plantas de N. benthamiana. 


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