RESUM

La utilització de plantes com a biofactories s'ha proposat com una opció senzilla, econòmica i mes segura per a la producció biotecnològica de proteïnes heteròlogues i d'altres productes d'aplicació en medicina i industria. Tanmateix, els virus de vegetals poden ser una ferramenta molt eficient per a la obtenció d'estos productes, gràcies a la facilitat natural d'infectar, envair les plantes i expressar la seua informació genètica eficientment. Entre ells es troba el virus del gravat del tabac (Tobacco etch virus, TEV), un virus d'RNA de cadena positiva de la família Potyviridae amplament empleat en estudis sobre la biologia molecular de virus de plantes e interaccions planta-patogen. Basant-se en un clon infecciós d'este virus, en el present estudi s'ha desenvolupat un vector viral desarmat que permet l'expressió simultània de múltiples proteïnes heteròlogues en plantes.

Donat que l'únic clon infecciós disponible d'este virus era inestable durant la seua amplificació en bactèries com Escherichia coli, com a primera etapa per al desenvolupament del vector d'expressió, es dissenyaren i construïren tres nous plasmidis amb el mateix clon infecciós del TEV que permeteren infectar plantes amb RNA transcrit in vitro (pMTEV), directament amb DNA (p35TEV) o per agroinoculació (pGTEV). En la seua construcció s'eliminaren les seqüències considerades supèrflues en els plasmidis corresponents i s'orientaren els distints elements funcionals de forma lògica per a augmentar l'estabilitat del cDNA viral durant la seua propagació en bacteris. Els tres nous plasmidis resultaren molt mes estables que l'ancestral i permeteren infectar eficientment plantes de tabac mitjançant RNA transcrit, directament amb DNA plasmídic o per agroinoculació.

El vector d'expressió es va construir sobre la base del plasmidi per a agroinoculació pGTEV. En el vector, el cistró que codifica la RNA polimerasa RNA depenent (proteïna NIb) es va reemplaçar per un casset que contenia els cDNAs de les distintes proteïnes heteròlogues a expressar. Estos cDNAs foren flanquejats per les seqüencies corresponents a llocs de tall naturals i artificials de la proteasa viral NIaPro per a assegurar el correcte processament de les proteïnes heteròlogues a partir de la poliproteïna viral. Es construïren varies versions del vector d'expressió, entre les que destaquen el vector que expressa tres proteïnes fluorescents, roja (mCherry), groga (Venus) i blava (mTagBFP), i el que expressa dos factors de transcripció d'Antirrhinum majus (Delila i Rosea1) de la ruta de biosíntesi d'antocianines. Al inocular plantes de tabac (Nicotiana tabacum) transgèniques, que suplementen la funció NIb a través d'un transgèn, es va detectar l'expressió colocalitzada de les tres proteïnes fluorescents tant a nivell de teixit com subcel·lular. També es va comprovar l'eficient processament de cada proteïna heteròloga a partir de la poliproteïna viral. Finalment, es va comprovar que el vector al qui li manca el cistró de la seua RNA polimerasa es incapaç d'infectar plantes en les que la funció no es suplementada, la qual cosa suposa un important element de biocontenció de la tecnologia. En el cas de l'expressió dels dos factors de transcripció que activen la biosíntesi d'antocianines, la inoculació de les plantes transgèniques que expressen NIb va provocar una forta acumulació d'estos compostos en els teixits infectats per el virus que van adquirir una forta coloració vermella. Estos resultats avalen la utilitat del nou vector per a expressar proteïnes heterooligomèriques que requereixen un correcte encoblament dels seus múltiples components i en enginyeria metabòlica de plantes.

A continuació, per a millorar els nivells d'expressió de les proteïnes heteròlogues a partir del vector viral basat en el TEV, es va analitzar el efecte d'inserir un segon supressor viral del silenciament induït per RNA. Els resultats sobre un vector que expressa la proteïna fluorescent roja mCherry van mostrar que la coexpressió de la proteïna P19 del virus del nanisme arbustiu de la tomata (TBSV) augmenta l'expressió en aproximadament un 50%, i la proteïna 2b del virus del mosaic del cogombre (CMV) la augmenta un 20%. En contrast, la proteïna 16K del virus del cascavelleig del tabac (TRV) no té ningun efecte, mentre que la proteïna HC-Pro d'un altre potyvirus, el virus de la sharka de la pruna, té un efecte negatiu. En una segona estratègia per a millorar el vector d'expressió desarmat basat en el TEV, es va estudiar quins altres cistrons del genoma del virus podrien transferir-se a la planta hoste. Utilitzant una estratègia d'expressió transitòria en plantes de Nicotiana benthamiana, es van identificar nous cistrons que es podrien eliminar del vector i ser suplementats en trans, la qual cosa millorarà la capacitat d'albergar informació genètica heteròloga per part del vector.

Finalment, els estudies d'expressió de factors de transcripció de la ruta de les antocianines portaren al desenvolupament d'un nou sistema per a seguir visualment la dinàmica d'un procés de infecció viral en plantes. El sistema es basa en la expressió del factor de transcripció Rosea1 (Ros1) de 25.7 kDa que indueix la acumulació d'antocianines acolorides en els teixits en els que el virus es replica i es mou. La quantitat de pigment roig es va observar correlacionada amb la càrrega viral, per el que el marcador va resultar ser quantitatiu. A demés, este marcador va mostrar ser molt estable durant passes infectius seriats en plantes de tabac. A demés de la infecció del TEV en plantes de tabac, el marcador va mostrar ser útil per seguir la infecció del potyvirus del mosaic del nap en plantes d'Arabidopsis thaliana i del virus mosaic del tabac o el virus X de la creïlla en plantes de N. benthamiana.





3