RESUMEN
      El control de residuos de sustancias antimicrobianas en productos de origen animal, entre los que se encuentra la leche, es de gran importancia, ya que pueden ocasionar problemas al consumidor (alergias, trastornos digestivos, resistencias a medicamentos, etc.) y, además, causar interferencias en la fabricación de productos lácteos ocasionando graves pérdidas económicas en la industria láctea.
	Por ello, resulta conveniente establecer un adecuado sistema de control de la presencia de residuos de aquellos antimicrobianos más utilizados en el ganado vacuno lechero, mediante métodos eficaces y prácticos que pueden ser utilizados en las explotaciones ganaderas y centros lácteos, y así evitar su llegada al consumidor.
      Debido a la diversidad de métodos analíticos disponibles en el mercado para la detección de antibióticos se planteó el estudio de la selectividad y sensibilidad de los métodos microbiológicos y específicos más utilizados en la etapa de cribado.
	En el estudio de selectividad se emplearon 14 métodos (7 microbiológicos y 7 específicos) y se analizaron, por triplicado, 100 muestras de leche procedentes de animales no tratados con ningún medicamento. La selectividad obtenida para los métodos microbiológicos fue muy elevada: BRT AiM (99%), Blue Yellow (100%), CMT Copan (100%), Delvotest MCS Accelerator (98%), Delvotest SP-NT (98%), Eclipse 50 (99%) y Eclipse 100 (99%) y no presentó diferencias significativas entre los métodos. También la selectividad calculada para los métodos específicos alcanzó valores elevados: Beta Star (97%), Delvo XP (99%), Rosa MRL BL (100%), Rosa TET (99%), Snap BL y Snap TET (100%) y Twinsensor BL (100%) y Twinsensor TET (98%) que no presentaron diferencias significativas (p<0,05), mientras que el método Penzym fue el único en el que la selectividad resultó más baja (82%) con un elevado porcentaje de resultados dudosos y estadísticamente fue diferente al resto de métodos específicos.
      En cuanto a la sensibilidad se calculó utilizando muestras de leche, procedentes de la mezcla de 30 animales individuales. Se ensayaron 20 sustancias antimicrobianas y se estudiaron a tres concentraciones distintas (0,5 LMR, LMR y 2 LMR), aunque en algunos casos se ensayaron diferentes concentraciones (LMR, 2 LMR y 4 LMR o 0,25 LMR, 0,5 LMR y LMR) dependiendo de la proximidad de los límites de detección de los métodos a los Límites Máximos de Residuos (LMRs) de cada antibiótico. Se analizaron 30 repeticiones de cada concentración para los métodos microbiológicos y 10 repeticiones para los específicos. 
      Los métodos microbiológicos presentaron, en general, una sensibilidad elevada para los antibióticos betalactámicos a una concentración equivalente a sus LMRs. En el caso de los métodos específicos a betalactámicos, los resultados fueron variables según el método y la molécula ensayada. Sin embargo la sensibilidad de estos métodos fue elevada al LMR para la penicilina G, cefalexina, cefalonio, cefoperazona, cefquinoma y ceftiofur. 
	Para los otros grupos de antimicrobianos estudiados (aminoglucósidos, macrólidos, quinolonas y tetraciclinas), los métodos microbiológicos no fueron capaces de detectar ninguna de las sustancias estudiadas al LMR, excepto en algunos casos como la neomicina con el BRT AiM, Blue Yellow y Delvotest SP-NT que presentaron una sensibilidad del 100% al LMR.
	En cuanto a los métodos específicos a tetraciclinas, todos los métodos ensayados (Rosa TET, Snap TET y Twinsensor) presentaron una sensibilidad del 100% para la detección de oxitetraciclina al LMR (100 µg/Kg) aunque el Rosa TET y el Snap TET obtuvieron esta sensibilidad a una concentración equivalente a 0,5 LMR (50 µg/Kg). También la gentamicina y enrofloxacina fueron analizadas por sus correspondientes métodos específicos (Snap Gentamicin, Equinox y Rosa Enrofloxacin) con una sensibilidad en todos los casos del 100% al Límite Máximo de Residuos.
      A partir de los resultados de sensibilidad obtenidos se aplicó el Análisis Multivariante de Conglomerados (Cluster) y el Análisis por Componentes Principales (PCA). Los resultados obtenidos mostraron que los métodos microbiológicos BRT AiM, Blue Yellow, CMT Copan, Delvotest MCS Accelerator, Delvotest SP-NT, Eclipse 50 y Eclipse 100 presentaron un comportamiento similar respecto a los resultados de sensibilidad, lo mismo ocurre con los métodos específicos Beta Star, Twinsensor, Delvo XP, Rosa MRL BL y Snap BL.
      También con los resultados de sensibilidad obtenidos y las frecuencias de uso de las sustancias antimicrobianas más empleadas en el tratamiento del ganado vacuno lechero se han establecido distintas agrupaciones entre los métodos de cribado, para poder recomendar una combinación de métodos que permita garantizar el mayor espectro en la detección de antimicrobianos en la leche. A partir de los resultados se evidencia que no existe un único método que pueda cubrir la detección de la totalidad de los antibióticos. Así, con la aplicación de un método microbiológico se logra detectar entre el 51,3-70,4% de los antibióticos. Por otro lado, los métodos receptores proteicos a betalactámicos solo llegan a detectar entre el 29,7-54,6% de los antibióticos utilizados. Además, la utilización de dos métodos de cribado de forma simultánea “microbiológico-específico betalactámicos” no mejora notablemente la frecuencia de moléculas a detectar (65,8-71,5%) en comparación con los métodos microbiológicos, pero permite un control más eficiente, al efectuar dos controles por cada muestra de leche. 
      La incorporación de un método específico para la detección de residuos de tetraciclinas en leche a las combinaciones de “microbiológico-especifico betalactámicos” permite incrementar el porcentaje de cobertura de antibióticos en leche entre el 68,1-73,8%. Además, la incorporación en forma periódica de controles de gentamicina (5,7%) con el método Snap Gentamicin y enrofloxacina (2,3%) con los métodos Equinox o Enroflox permitiría llegar a detectar hasta el 81,8% de los antibióticos empleados en España para el ganado vacuno lechero.
      Por otra parte, ante los escasos estudios sobre el efecto de los factores metodológicos relacionados con la toma de muestras de la leche, se planteó la necesidad de realizar una evaluación sobre la influencia del tiempo de refrigeración y la presencia de azidiol sobre la respuesta de algunos de los métodos microbiológicos de cribado más utilizados en los laboratorios de control para la detección de los residuos de antibióticos en la leche.
      En este estudio se emplearon 12 concentraciones de amoxicilina, ampicilina, penicilina G y oxitetraciclina que se analizaron a las 0, 24, 48 y 72 horas de refrigeración a 4 ºC, con el objetivo de calcular las pérdidas relativas de actividad antimicrobiana para cada antibiótico, a partir de los límites de detección de los métodos, en muestras de leche sin conservante y con azidiol. Los resultados indicaron, de forma general, que la pérdida de actividad antimicrobiana (PAA) de los antibióticos aumentó con el tiempo de refrigeración de las muestras de leche y que estas pérdidas fueron menores en las muestras de leche con azidiol. Por ello, en caso de recurrir a la refrigeración de las muestras de leche sería conveniente el uso de azidiol y realizar el análisis dentro de las primeras 48 horas de su llegada al laboratorio.
      Dada la importancia de la presencia de residuos de medicamentos en la leche para la Seguridad Alimentaria, se considera conveniente continuar con los estudios sobre métodos de detección de antibióticos y desarrollar metodologías analíticas con espectros de detección más amplios para el análisis de otros grupos de antimicrobianos, como los aminoglucósidos, macrólidos y quinolonas, dada su elevada frecuencia de uso en vacuno lechero y la falta de sensibilidad de los actuales métodos de cribado. La implementación del actual sistema de control con otros métodos específicos o con métodos de mayor espectro de detección permitiría establecer una estrategia analítica más conveniente que la aplicada en la actualidad.