RESUMEN
   La presencia de residuos de antibióticos en alimentos de origen animal es uno de los problemas más importantes y actuales en seguridad alimentaria. Los medicamentos son utilizados en la producción animal con fines terapéuticos y como promotores del crecimiento. El problema surge cuando residuos de estos antibióticos llegan al consumidor a través de la cadena alimentaria a niveles perjudiciales para su salud, ya que tienen efectos secundarios al destruir las bacterias comensales de nuestro intestino y al provocar reacciones alérgicas, además de contribuir a la aparición de bacterias resistentes.
   A efectos normativos, en el reglamento CE No 470/2009 se establecen procedimientos comunitarios para la fijación de los límites máximos de residuos (LMR) de las sustancias farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal. Así, para la mayoría de los antibióticos usados con fines veterinarios y dependiendo del tejido, el LMR varía entre 5 y 600 µg/kg.
   Actualmente, la determinación de tetraciclinas y sulfonamidas se lleva a cabo, principalmente, mediante cromatografía liquida (HPLC) con detección fluorescente, UV o por espectrometría de masas (MS). El método es complicado y sobre todo caro. Además, la etapa de preparación y purificación de muestra requerida para obtener un alto grado de pureza es laboriosa, lo que unido a la baja capacidad de trabajo y el coste de los análisis, hacen que esta metodología sea poco adecuada para implementar programas de vigilancia y control que aseguren la inocuidad de los alimentos. Los métodos de barrido son los utilizados comúnmente para detectar residuos de antibióticos en alimentos previamente al análisis confirmativo. Estos métodos deben ser semicuantitativos, rápidos, robustos y relativamente baratos. Entre los métodos de barrido (screening) utilizados para detectar residuos de antibióticos se encuentran principalmente los cromatográficos, los microbiológicos y los inmunológicos.
   Esta Tesis se ha centrado en el desarrollo de inmunorreactivos y sistemas analíticos de barrido basados en métodos inmunoquímicos (ELISA), dirigida a la detección de residuos de antibióticos en alimentos, concretamente sulfonamidas y tetraciclinas. Las técnicas puestas a punto permitirán conocer el nivel de residuos de estos analitos de forma rápida, sensible, económica y fiable, con un tratamiento de muestra mínimo y por personal no cualificado.
   En primer lugar, se abordó la síntesis de haptenos para la obtención de anticuerpos contra distintos compuestos de la familia de las sulfonamidas y tetraciclinas. Así, se sintetizaron diferentes moléculas manteniendo la estructura base de cada grupo de antibióticos (región constante) y se funcionalizaron con grupos carboxilo con el fin de obtener los inmunógenos, los conjugados de tapizado y los trazadores enzimáticos, disponiéndose de los reactivos necesarios para poner a punto los ensayos. En todos los casos se procedió a obtener anticuerpos policlonales por inmunización de conejos, que han demostrado ser efectivos y de fácil obtención, tanto en lo que respecta a la técnica operativa como a los tiempos de respuesta.
   Los sueros obtenidos se caracterizaron (sensibilidad y selectividad) mediante ELISA, estableciendo las concentraciones óptimas de inmunorreactivos y los formatos de ensayo. Después de la puesta a punto de varios ensayos se seleccionaron los más específicos, dos para sulfonamidas, (sulfatiazol, STZ y sulfasalazina, SSZ) y uno para tetraciclinas (clortetraciclina, CTC).
   Por otro lado, se obtuvieron inmunorreactivos genéricos (baja selectividad) hacia algunas de las sulfonamidas y tetraciclinas de mayor uso, lo que permitió desarrollar dos inmunoensayos multirresiduo.
   Posteriormente se optimizaron los factores físico-químicos que pueden influir en la interacción antígeno-anticuerpo como la fuerza iónica del medio, tiempo de incubación, pH y concentración de tensoactivos. Los inmunoensayos específicos más sensibles presentaron valores de IC50 de 1,6 µg/L para STZ, 0,51 µg/L para SSZ y 36,40 µg/L para CTC, mientras que en los genéricos la IC50 fue 1,32 µg/L expresada como equivalentes de STZ y 6,5 µg/L expresada como tetraciclina. Todos los ELISAs desarrollados para sulfonamidas y tetraciclinas presentaron buena sensibilidad, a niveles de µg/L, siendo inferiores a los LMRs establecidos por la legislación.
   Finalmente, se evaluó el potencial analítico de los inmunoensayos desarrollados mediante su aplicación a la determinación de residuos de sulfonamidas y tetraciclinas en miel. Los resultados mostraron recuperaciones excelentes (recuperación media, 97%), resultando una metodología muy interesante para la implementación de Planes de Vigilancias, con tratamiento de muestra mínimo.