RESUM
       
       
       

       Els virus de plantes causen cada any importants pèrdues econòmiques en cultius agrícoles de tot el món. La infecció viral és un procés complexe on es produeixen la replicació i expressió del genoma del virus dins de la cèl·lula hospedadora, el moviment del virus entre cèl·lules i a través del floema, i la transmissió a altres plantes mitjançant vectors que generalment són insectes. A més a més, el virus cal que siga capaç de contrarestar els mecanismes de defensa de la planta (silenciament gènic, resistència sistèmica adquirida, resposta hipersensible, etc.). Açò requereix moltes interaccions entre el virus i els seus hospedadors, amb els vectors i en ocasions amb altres virus que coinfecten la mateixa planta. Actualment, el control de les malalties virals es basa en mesures profilàctiques per impedir o dificultar la dispersió dels virus i en el cultiu de varietats resistents a virus obtingudes per millora genética o ingeneria genética. Per aplicar aquestos mètodes de control cal disposar de tècniques que permeten la detecció i el diagnòstic ràpid, sensible i específic del virus. En molts casos és útil aplicar tècniques per a estimar l'acumulació del virus, com per exemple per a avaluar la resistència parcial de certes varietats.
       El coneixement dels factors implicats en l'evolució dels virus és crucial per a entendre els processos implicats en la biologia molecular i l'epidemiologia dels virus (inclosa l'emergència de noves virosis), així com per a desenvolupar estratègies de control que siguen més eficaces i duradores. La finalitat d' esta tesi és estudiar com alguns aspectes del cicle vital dels virus poden afectar l'eficàcia biològica (fitness) i determinar l'evolució dels Virus del marciment 1 de la fava (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1) i del mosaic del tabac (Tobacco mosaic virus, TMV)
       En primer lloc, es van desenvolupar les ferramentes metodològiques necessàries per a dur a terme estos estudis. Així, es va posar a punt el mètode d'hibridació molecular de flux d'empremtes vegetals que va permetre la detecció de BBWV-1 en tan sols 30 minuts sense necessitat de processar les mostres. Es va desenvolupar RT-PCR a temps real que va permetre una quantificació absoluta de BBWV-1 i TMV, així com altres dos virus relacionats (BBWV-2 i el virus del mosaic de la colza, Oilseed rap mosaic virus, ORMV). Esta tècnica va permetre detectar i quantificar estos virus amb un ampli rang dinàmic i amb una alta sensibilitat (1000-1000  molècules de RNA viral). L'última ferramenta desenvolupada va ser la construcció de clons de cDNA del genoma complet de BBWV-1 que va servir per a generar transcrits amb la mateixa capacitat d'infecció, inducció de símptomes i acumulació en plantes que l'aïllat de BBWV-1 usat per a obtindre els dits clons. 
       Amb això es van estudiar diversos aspectes que podrien afectar l'eficàcia biològica de BBWV-1. Es va observar que l'acumulació de BBWV-1 seguia un patró temporal consistent en un increment exponencial del títol viral fins a aconseguir un màxim seguit per una disminució del títol viral fins a arribar a un mínim i un posterior augment fins a arribar a un títol viral estable (plateau) amb xicotetes fluctuacions. Aquest patró va ser observat en fava (Vicia faba) i en Chenopodium quinoa amb un desfasament temporal. Es va provar inocular el virus a tres concentracions (dilucions 1/10 i 1/100) i en dos estats de desenvolupament de la planta (primeres dues fulles vertaderes i quatre fulles vertaderes) i es va constatar de que tenien un efecte mínim en l'acumulació viral. També es va avaluar l'efecte que tenia en la infecció de BBWV-1 el tractament de plantes de fava amb Acibenzolar-S-methyl (BTH), que és un activador de la resistència sistèmica adquirida (systemic acquired resistance, SAR). Aquest tractament va produir el descens de la infectivitat viral però no va afectar l'acumulació viral de les plantes que havien sigut infectades. Este efecte va ser major quan la freqüència d'aplicació i les dosis es van incrementar. Un altre aspecte que es va estudiar va ser la interacció de BBWV-1 amb el Virus del bronzejat de la tomaca (Tomato spotted wilt virus, TSWV) en fava. TSWV induïx una resposta hipersensible (hypersensitive response, HR) en fava que es manifesta per lesions locals que confinen el virus i impedixen o dificulten el seu moviment per la planta. Quan es coinocularen BBWV-1 i TSWV en plantes de fava es va produir una resposta hipersensible. TSWV no es va detectar en les plantes inoculades, mentre que es va produir una disminució dràstica en la infectividad de BBWV-1 (menor o igual al 15%) en comparació amb les plantes inoculades només amb BBWV-1 (major o igual al 80%). En plantes inoculades amb TSWV quatre dies abans d´inocular-les amb BBWV-1 es va produir una disminució moderada de la infectivitat de BBWV-1 (60%). L'acumulació de BBWV-1 en les plantes infectades no es va veure afectada per la coinoculació amb TSWV. L'últim aspecte que s'estudià sobre l'eficàcia de BBWV-1 va ser la transmissibilitat per pugons. Es van realitzar assajos de transmissió amb dos aïllats de BBWV-1 amb nou espècies de pugons usant diferents fonts d'inòcul. Este estudi va revelar que el títol viral en la planta on el pugó va adquirir el virus estava correlacionat amb la taxa de transmissió. Algunes espècies de pugó van transmetre BBWV-1 de manera més eficient que altres, però no es van observar diferències significatives en la transmissibilitat d'ambdós aïllats de BBWV-1 quan es va tindre en compte l'acumulació viral de la planta font.
       Per últim, es va estudiar l'efecte d'alguns aspectes implicats en la interacció de TMV amb Arabidopsis thaliana. Primer es va estimar l'acumulació temporal de TMV i es va comparar amb la d'ORMV en els mutants d’A. thaliana: tor1 i tor2 que tenen la dinamicitat dels microtúbuls alterada i en els mutants npr1, amb un nivell de defensa reduït, i cpr5, amb un nivell de defensa augmentat. L'acumulació d'ORMV no va paréixer afectada per estes mutacions mentre que l'acumulació en TMV va disminuir dràsticament en els mutants cpr5. Per a estudiar la capacitat d'adaptació de TMV a estos mutants es va realitzar un experiment d'evolució experimental consistent en passatges seriats de TMV en dos ecotips de A. thaliana i en els quatre mutants mencionats realitzant tres rèpliques independents per cadascú, que es van considerar com a distints llinatges de TMV. L'anàlisi nucleotídic del genoma va mostrar 12 substitucions aminoacídiques i 8 substitucions nucleotídiques sinònimes en 12 llinatges amb respecte el seu avantpassat (el virus original). L'anàlisi temporal de la infectivitat i acumulació d'estos llinatges en els ecotips i mutants d’A. thaliana va suggerir que les plantes corresponents als mutants tor1 i en especial tor2 podrien haver induït canvis genètics en TMV que afectaren la infectivitat o acumulació viral. No es va trobar cap efecte o si ho va haver-hi va ser mínim en els llinatges evolucionats en les plantes mutants npr1 i cpr5.