Resumen El virus de la rotura del color de la flor del Pelargonium (Pelargonium flower break virus, PFBV) se encuentra asignado al género Carmovirus dentro de la familia Tombusviridae, y como el resto de los miembros de este grupo, posee un genoma monopartido de RNA simple cadena (ssRNA) y polaridad positiva de aproximadamente 4 kb, que se encapsida en partículas isométricas de 30 nm de diámetro. El RNA genómico del virus muestra una organización similar al resto de carmovirus, con cinco marcos abiertos de lectura (open reading frames, ORF) y dos regiones no codificantes de 32 y 236 nt en los extremos 5´ y 3´, respectivamente. La ORF 1, situada en 5´, codifica una proteína de 27 kDa (p27) que termina en un codón ámbar, cuya lectura a través permite la traducción de la ORF 2, dando lugar a una proteína de 86 kDa (p86). Tanto p27 como p86 presentan gran homología con proteínas implicadas en la replicación en otros carmovirus. La proteína p86 contiene los motivos característicos de las RNA polimerasas dependientes de RNA, mientras que p27 no posee ningún motivo que explique su supuesta implicación en la replicación. Las dos ORF centrales (ORF 3 y 4) codifican dos pequeñas proteínas de 7 y 12 kDa (p7 y p12), presuntamente implicadas en el movimiento intracelular e intercelular del patógeno, y la ORF 5 codifica un polipéptido de 37 kDa (p37) que se ajusta al patrón estructural de las proteínas de cubierta (CP) del género Carmovirus y, de forma más general, de la familia Tombusviridae. En este trabajo se ha establecido la etapa del ciclo infeccioso en la que se encuentran involucradas las distintas proteínas del PFBV y se han analizado relaciones estructura-función en dichos productos, centrándonos en ciertos rasgos atípicos y/o propiedades escasamente caracterizadas en virus relacionados. El estudio de los productos codificados por las ORF 1 y 2 ha demostrado que tanto la proteína p27 como p86 son necesarias para la replicación del virus. La expresión en plantas y en levaduras de ambas replicasas fusionadas a proteínas fluorescentes y su posterior observación en el microscopio confocal, ha permitido determinar que ambas moléculas se dirigen de forma independiente a las mitocondrias, donde co-localizan y no inducen alteraciones visibles en la morfología o distribución de estos orgánulos. Un análisis de las señales que guían el direccionamiento mitocondrial de p27 ha revelado la implicación en el mismo de dos regiones, una de 29 residuos situada hacia el extremo amino terminal de la proteína y otra de 27 residuos que coincide con el extremo carboxilo terminal. Predicciones in silico apuntan a la presencia de hélices-alfa anfipáticas en las regiones identificadas que podrían mediar la asociación de p27 a las membranas mitocondriales. Dicha asociación parece ser, además, independiente de muchos de los factores celulares que intervienen en la importación de proteínas a mitocondrias, ya que la ausencia de los mismos no afecta a la localización subcelular de p27, al menos en levaduras. Estudios adicionales con la proteína p27 han mostrado que es capaz de unir RNA in vitro, con una elevada afinidad y siguiendo una cinética de cooperatividad positiva. Los resultados de ensayos de competición han sugerido que la proteína se une preferentemente a ssRNAs, y en particular a aquellos derivados del genoma viral, aunque también puede unir otros tipos de ácidos nucleicos (dsRNAs, ssDNAs, dsDNAs) con menor eficiencia. El hecho de que el complejo p27:ssRNA se mantenga estable frente a concentraciones salinas elevadas, sugiere que las interacciones iónicas no son las únicas que contribuyen a su formación/estabilidad. El análisis de versiones truncadas de p27 ha permitido identificar tres regiones de 40, 30 y 70 residuos aminoacídicos, respectivamente, que contribuyen de forma diferencial y aditiva a la unión al ácido nucleico. Tanto la localización mitocondrial como las propiedades de unión a RNA observadas para la replicasa de menor tamaño del PFBV sugieren que ésta desempeña un papel importante durante la replicación del patógeno, probablemente reclutando el molde de RNA y dirigiendo todo el complejo replicativo hacia las mitocondrias, donde presumiblemente tiene lugar la síntesis del RNA del virus. Por otra parte, hemos confirmado el requerimiento in vivo de los pequeños polipéptidos codificados por las ORF 3 y 4, p7 y p12, para el movimiento del virus. Con el fin de obtener información sobre el modo de acción de al menos uno de estos productos virales, hemos determinado la localización subcelular de la proteína p12 y evaluado la posible relevancia funcional de algunas características atípicas que presenta, como son un putativo motivo tipo cremallera de leucina (leucine zipper, LZ) y una extensión N-t rica en residuos básicos. Los resultados obtenidos indican que p12 se une a membranas subcelulares, fundamentalmente del retículo endoplásmico, en concordancia con su perfil hidrofóbico y con lo observado para otras proteínas de movimiento, incluyendo las del género Carmovirus. Además, hemos concluido que el presunto LZ es necesario para el transporte célula a célula del virus y que la extensión N-t básica confiere a p12 propiedades de unión a RNA que están mediadas por residuos cargados positivamente. Estas últimas características no son compartidas por proteínas homólogas, lo que sugiere que el movimiento del PFBV puede diferir significativamente respecto al de virus relacionados. Finalmente, hemos ensayado la capacidad de todas las proteínas codificadas por el PFBV de inhibir el silenciamiento por RNA, utilizando para ello un ensayo de expresión transitoria en plantas. Nuestros resultados han mostrado que la proteína p37 del virus es un fuerte supresor del silenciamiento, en línea con lo descrito previamente para las CP de al menos dos miembros del género Carmovirus. Asimismo, hemos observado que esta proteína es capaz de unirse in vitro a pequeños RNAs interferentes (small interfering RNAs, siRNAs), una capacidad que se correlaciona in vivo con la actividad supresora del silenciamiento y con el aumento de la patogenicidad de un virus heterólogo. En conjunto, estos resultados sugieren que p37 inhibe el silenciamiento por RNA secuestrando siRNAs y previniendo su incorporación al complejo de silenciamiento inducido por RNA, un mecanismo ampliamente utilizado por supresores no relacionados.