RESUMEN

La clorosis férrica es uno de los estreses abióticos más importantes para las plantas, y como tal, resulta un problema agrícola muy extendido especialmente para aquellos cultivos que se desarrollan en terrenos calizos, como es el caso de los cítricos en la Comunidad Valenciana.
El objetivo de este trabajo fue caracterizar el sistema de absorción de hierro en los cítricos y su respuesta ante distintas situaciones clorosantes que comprometen la disponibilidad del elemento, provocando la deficiencia de Fe en la planta. Los componentes del sistema de absorción del Fe -acidificación del medio, reducción del Fe(III), transporte a través de la membrana y alteración de la síntesis de ácidos orgánicos-, se analizaron a nivel fisiológico, bioquímico y molecular, en condiciones de ausencia de Fe externo, presencia de bicarbonato (HCO3-) y de otros micronutrientes como zinc (Zn) y manganeso (Mn).
	Para la consecución de estos objetivos se utilizaron diversos genotipos de cítricos con diferente tolerancia a la clorosis férrica y se simularon diferentes condiciones clorosantes en el medio de cultivo, ya fuera eliminando el Fe o adicionando iones HCO3-, Zn2+ o Mn2+. En los distintos experimentos se evaluó, según cada caso, el crecimiento vegetativo de las plantas, el contenido de Fe total en los distintos órganos y en el apoplasto de la raíz, así como el estado del aparato fotosintético de las hojas tras la inducción de la clorosis. Así mismo, se determinó la capacidad de reducción y acidificación de las raíces, mediante el análisis de las actividades de los principales enzimas involucrados, como son la Quelato Férrico Reductasa (FC-R), la Protón-ATPasa (H+-ATPasa), la Fosfoenol Piruvato Carboxilasa (PEPCasa) y otros enzimas que intervienen en la biosíntesis de ácidos orgánicos, como la malato deshidrogenasa (MDH), la piruvato kinasa (PK), el enzima málico (ME), la citrato sintasa (CS), la aconitasa (ACO) y la fumarasa (FUM). Adicionalmente, se identificaron en el genoma de los cítricos las secuencias homólogas a los genes FRO1, FRO2, HA1, HA2, IRT1 e IRT2 de Arabidopsis thaliana, que codifican para los enzimas FC-R y H+-ATPasa y para los principales transportadores de hierro. También se homologaron las secuencias de PEPC1, cMDH, ME, CS, ACO, FUM, mMDH y DTC que codifican para los correspondientes enzimas del ciclo de Krebs y para el transportador de ácidos di-tricarboxílicos mitodondrial. En todos los casos, se diseñaron los oligonucleóticos correspondientes que permitieron analizar su expresión génica utilizando RT-PCR. Finalmente, se determinó la tasa de absorción de hierro por la raíz y su transporte en la planta mediante la técnica de dilución isotópica.
	Los resultados del trabajo mostraron que la deficiencia de Fe aumenta la expresión de los genes FRO2 y HA1 que codifican para los enzimas FC-R y H+-ATPasa, así como la del gen del transportador férrico IRT1. Este hecho se confirmó con la inducción de las correspondientes actividades enzimáticas, así como con el aumento de la absorción de 57Fe. El genotipo tolerante, mandarino Cleopatra, presenta mayor actividad FC-R que el sensible, citrange Carrizo, y mayor capacidad de acumulación de Fe en el apoplasto de la raíz. En condiciones de clorosis férrica, las raíces de los cítricos acumulan ácidos orgánicos como consecuencia de la activación de algunas enzimas del ciclo de Krebs, como PEPCasa, MDH, CS y FUM; así como la del transportador de ácidos DTC. Los ácidos mayoritarios son citrato y malato, que una vez sintetizados en las raíces son liberados al xilema (para favorecer el transporte de Fe a larga distancia) o al exterior (para acidificar la rizosfera). La presencia de bicarbonato en el medio induce la clorosis férrica, con la consiguiente alteración del aparato fotosintético de las hojas y la reducción del crecimiento de la planta, especialmente acusado en las raíces. El ión HCO3- inhibe la absorción del hierro por las raíces, lo que se traduce en una reducción de la concentración de Fe en los órganos de la planta. Este efecto parece ser debido al bloqueo de la acidificación del medio causado por el poder tampón del HCO3-. Como resultado de la disminución de la absorción de Fe por efecto del bicarbonato, se produce una disminución de la concentración de Fe en las raíces, que a su vez, induce las respuestas a la deficiencia de este elemento. Además, el bicarbonato dificulta el transporte del Fe desde las raíces a la parte aérea y también bloquea la movilización del Fe desde los cotiledones a la radícula en plántulas a las que no se les suministró Fe externo. La presencia de concentraciones relativamente elevadas de Zn2+ o Mn2+ en el medio reduce la absorción del Fe. Esto parece ser debido a un efecto competitivo en el transporte a través de la membrana plasmática, ya que las respuestas a la deficiencia de hierro se activan al disminuir la entrada de Fe en las células radiculares.
De acuerdo con la información obtenida se concluye que la capacidad de absorción de hierro en cítricos aumenta en ausencia de Fe en el medio, debido a la activación de los componentes del sistema de absorción de este elemento. Además, se aprecia que todas las respuestas a la deficiencia de Fe de las raíces están metabólicamente inter-correlacionadas unas con otras y colaboran en la absorción de este elemento por la planta, solubilizando el Fe mediante la acidificación de la rizosfera, reduciendo el ion Fe3+ a Fe2+ absorbible por la planta, y activando los transportadores de hierro de la membrana plasmática de la raíz. El nivel de tolerancia de los cítricos a la clorosis férrica está determinado por el grado de respuesta de los componentes del sistema de absorción de Fe ante una situación clorosante, donde el papel de la enzima FC-R es especialmente importante.