Resumen El principal objetivo de esta Tesis Doctoral es el estudio de la conectividad funcional del cerebro in vivo combinando imagen por resonancia magnética funcional con microestimulación eléctrica cerebral en animales de experimentación. Esta Tesis Doctoral se enmarca en un equipo multidisciplinar fruto de la estrecha colaboración que mantienen el Centro de Biomateriales e Ingeniería Tisular de la Universitat Politècnica de València y el Instituto de Neurociencias de Alicante del Consejo Superior de Investigaciones Científicas–Universidad Miguel Hernández. El estudio de la conectividad funcional es de gran interés en la neurobiología básica actual y una pieza fundamental en la investigación preclínica de enfermedades psiquiátricas. No en vano, se trata del mecanismo sobre el que se fundamentan dos de los principios básicos de la neurobiología: la especialización y la integración funcional. El sistema nervioso implementa un procesamiento altamente distribuido de la información, con módulos especializados en aspectos específicos del procesamiento que se combinan entre sí de manera integral. Por ejemplo, la experiencia multisensorial de un episodio cotidiano se experimenta como una percepción única (o integrada). En este contexto, la conectividad eficiente entre módulos funcionales, o conectividad funcional, es un requisito indispensable. Para ser eficiente, dicha conectividad debe adaptarse a las necesidades del sistema en un entorno –el medio en que se desenvuelve el organismo– que está en continuo cambio. Por tanto, la configuración funcional del network es una característica dinámica determinada por mecanismos de plasticidad sináptica, adaptación y modulación, que define el flujo de información en el sistema. La gran similitud entre algunos modelos cerebrales (como el de los monos o ratas) y el cerebro humano, hace que la experimentación con animales permita extrapolar con relativa sencillez muchas de las conclusiones que sobre ellos se deriven. Los métodos de análisis para el estudio de la conectividad funcional que aquí se presentan se han aplicado al caso específico de imágenes de resonancia magnética funcional de cerebros de rata que se estimulan eléctricamente. Para detectar las redes cerebrales que se conectan funcionalmente se han utilizado técnicas que asumen la correlación entre señales hemodinámicas cerebrales como indicadores de la conectividad, ya sea a partir del análisis estándar de la correlación cruzada o a partir de medidas multivariadas para la detección de patrones de varianza/covarianza. Los seis primeros capítulos de la memoria introducen las bases teóricas y de conocimiento que permiten el diseño y desarrollo de todos aquellos métodos que se presentan como herramientas para nuestro estudio de la conectividad funcional. En esta primera parte de la Tesis Doctoral se exponen los siguientes conceptos clave: 1. Que la neurociencia moderna se postula en base a la doctrina de la neurona—una teoría que describe al cerebro humano como un sistema formado por billones de elementos discretos especializados en realizar operaciones muy concretas (llamados neuronas), que se conectan (a través de unas pequeñas conexiones electroquímicas llamadas sinapsis) con otros elementos o neuronas similares formando redes de mundo pequeño que responden de forma concreta frente a familias de estímulos determinados. 2. Que una de las formas más eficientes, en la actualidad, de estudiar la conectividad funcional es a través de las imágenes de resonancia magnética funcional (o IRMf) y el modelo lineal general, el cual permite la construcción de mapas estadísticos paramétricos que localizan las regiones cerebrales involucradas en una tarea cognitiva o percepción sensorial determinada. Los mapas estadísticos paramétricos se construyen en base al principio de Fick y a la señal dependiente del nivel de oxigenación sanguínea o BOLD (por sus siglas en inglés: blood-oxygen-level-dependent), la cual predice con un alto grado de confidencia la actividad neuronal subyacente [1]. 3. Que para poder construir mapas estadísticos paramétricos que revelen de forma efectiva la actividad global neuronal son necesarias una serie de operaciones previas al análisis paramétrico, como son: el preprocesado de las imágenes funcionales, la modelización de las correlaciones serie o la normalización global—que previene el enmascaramiento de las respuestas funcionales segregadas. 4. Que la conectividad funcional es un concepto estadístico a través del cual se pretende cuantificar la información mutua entre las series temporales de eventos neurofisiológicos, y que uno de los mejores indicadores (o marcadores) de la conectividad funcional es la correlación entre señales BOLD-IRMf de uno o más vóxels que (por norma general) están separados anatómicamente. En este sentido, la asunción conectividad/correlación habilita multitud de técnicas de medida que van desde las más sencillas (como los análisis clásicos de correlación cruzada) hasta otras mucho más sofisticadas. Entre éstas últimas resultan muy populares las técnicas multivariadas basadas en la descomposición en componentes o coordenadas principales como por ejemplo la descomposición en valores singulares (o SVD, por sus siglas en inglés: single value decomposition) y la clasificación no supervisada o clustering. Una vez expuestos los principios y mecanismos metodológicos básicos para el estudio de la conectividad funcional, en el Capítulo 7 se presentan los procedimientos experimentales que permiten adquirir las imágenes por resonancia magnética del cerebro de ratas de experimentación. En los distintos experimentos se combina la adquisición de imágenes funcionales con la implantación de uno (o dos) electrodos de microestimulación eléctrica cerebral mediante los cuales se consigue provocar una activación neuronal controlada [2]. Todas las ratas se someten a un estricto protocolo quirúrgico que permite colocar con gran precisión los electrodos de estimulación en unas coordenadas predeterminadas y bien conocidas (hecho fundamental en el diseño de nuestros métodos de análisis, dado que permite la obtención y discusión de gran parte de los resultados que presentamos). Un complemento muy importante (indispensable en la mayoría de nuestros análisis) corresponde a un atlas anatómico multifuncional diseñado específicamente para el espacio anatómico de referencia de nuestros datos. La forma en que diseñamos dicho atlas cerebral de rata se presenta en un capítulo específico en la parte de métodos (vid. Capítulo 8—Síntesis de atlas tridimensionales para el estudio de la conectividad en cerebros de rata) dado que la metodología de diseño que presentamos se ideó para poder ser aplicada de forma genérica para la síntesis de atlas para espacios de referencia distintos al que asumimos como propio. Por lo demás, el estudio de la conectividad lo afrontamos mediante dos vías de desarrollo bien diferenciadas, que se fundamentan en dos paradigmas de análisis ortogonales pero complementarios (pues ambos asumen la correlación como el marcador de la conexión neuronal): - El primer grupo de métodos mide la conectividad funcional según la forma tradicional, es decir: en base a análisis de la correlación cruzada entre series temporales representativas de vóxels aislados o grupos de ellos. El uso de nuestro atlas cerebral multifuncional junto con un proceso iterativo que calcula la correlación cruzada entre todas las señales BOLD-IRMf medias de todas las regiones/etiquetas activas de cierto mapa estadístico paramétrico permite el cálculo de unas matrices cuadradas que revelan in vivo y dinámicamente el peso de las conexiones que identifican a cierto estado funcional. Dado que la estimulación eléctrica de un mismo núcleo cerebral debe mostrar un mismo patrón de modulación sináptica (incluso asumiendo el posible error experimental y la varianza en la respuesta funcional de cada sujeto), las matrices que calculamos (a las que llamamos huellas de conectividad) permiten el desarrollo de técnicas de clasificación de sujetos en base a estados funcionales concretos, y por tanto, las agrupaciones de sujetos revelan patrones de activación neuronal (o de conectividad funcional subyacente) reconocibles (y por tanto característicos) entre los sujetos de la población analizada (vid. Capítulo 9—Huellas de conectividad y análisis de grupos). - La segunda vía de desarrollo de nuestro estudio de la conectividad funcional en el cerebro de rata tiene que ver con la visión multivariada de los datos de IRMf a través de su descomposición en valores singulares. En concreto, el análisis multidimensional de los datos lo realizamos combinando SVD y un proceso de clustering. En primer lugar, realizamos una proyección SVD de las series de tiempo BOLD-IRMf conocida como espacio funcional—un sistema métrico en el que la distancia entre cualesquiera dos vóxels se relaciona con el grado de conectividad que existe entre ellos. En segundo lugar y en virtud de la abstracción conectividad/distancia, sometemos al espacio funcional a un proceso de clasificación no supervisada, procedimiento por el cual somos capaces de identificar, como miembros de un mismo cluster, a aquellos vóxels que están conectados funcionalmente entre sí y, por lo tanto, con una respuesta funcional media representativa del sistema. Dado que dos vóxels próximos en el espacio funcional pueden estar segregados anatómicamente, utilizamos las agrupaciones del espacio funcional para construir mapas multiparamétricos de la conectividad funcional que permiten expresar la respuesta funcional de los efectos neuronales globales como suma de varios modos hemodinámicos (vid. Capítulo 10—Sistemas funcionales). Finalmente, cabe mencionar que todas las metodologías de análisis de la conectividad funcional diseñadas en esta Tesis Doctoral han sido transcritas en decenas de funciones que, junto al atlas multifuncional del cerebro de rata que hemos diseñado específicamente para nuestros datos, nos permiten (a modo de resultados): 1. Crear un software de elaboración propia para el análisis de imágenes de resonancia magnética funcional de cerebros de rata que se estimulan eléctricamente. Dicho software (al que llamamos SPMrat) utiliza algunas funciones del paquete MATLAB conocido como SPM (SPM8, www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm8/) y permite de forma muy sencilla (a través de diálogos de pregunta/respuesta, funciones de fácil invocación e interfaces gráficas) un análisis integral y automático de las imágenes funcionales para el estudio de la conectividad funcional a partir del preprocesamiento de imágenes, el análisis de grupos de sujetos a partir de la clasificación de las huellas de conectividad o la extracción de sistemas funcionales a partir del análisis mean shift del sistema métrico de la conectividad funcional. 2. Sintetizar unas estructuras matriciales en representación de la actividad neuronal que revelan dinámicamente el sustrato anatómico asociable a un conjunto específico de conexiones establecidas (junto con sus pesos funcionales), identificando de forma única a cada sujeto aislado a partir de la actividad IRMf inducida. 3. Diseñar un clasificador de patrones de conectividad funcional (es decir, de las representaciones matriciales del apartado anterior o huellas de conectividad) que (a su vez) permite la identificación de los distintos estados funcionales que puedan generarse entre varios sujetos a los que se aplica uno o más paradigmas de estimulación eléctrica. 4. Implementar un procedimiento de clasificación no supervisada mediante el algoritmo mean shift que es capaz de extraer los modos de aquella distribución estadística que representa la conexión de los supra-vóxels representados en cierto espacio funcional y por tanto, la definición de clusters o sistemas funcionales identificables tanto espacialmente (a partir de unas máscaras binarias de membresía) como temporalmente (a partir de las señales medias BOLD-IRMf). 5. Elaborar unos mapas multiparamétricos que permiten expresar la respuesta funcional integrada en una suma de respuestas funcionales parciales, fundamentalmente a partir de la caracterización dispersiva de las funciones de respuesta hemodinámica según la propia descomposición mean shift del paso anterior. En base a dichos resultados, podemos derivar las siguientes conclusiones biomédicas: - Que las huellas de conectividad permiten predecir la posición de los electrodos de estimulación y los parámetros de estimulación empleados para generar las respuestas funcionales. Esto sugiere que trasladar estas técnicas al mundo clínico, y en concreto a las prácticas de la estimulación cerebral profunda, puede resultar muy beneficioso. Por ejemplo, puede confirmar la correcta implantación del electrodo y en caso contrario, modificar su posicionamiento para optimizar el resultado clínico—vid. capítulos 12, 13 y/o 15. - Que el algoritmo mean shift permite la descomposición de la respuesta funcional integrada en varias respuestas parciales que identifican a grupos de vóxels que están funcionalmente conectados entre sí, por lo que podemos: - Obtener conclusiones relativas a la causalidad o retardo sistemático [3] de las respuestas funcionales (según el principio del reposo inicial de los sistemas lineales invariantes en el tiempo). - Estudiar la conectividad efectiva a partir del uso de dos o más electrodos de estimulación cuyas respuestas evocadas se interfieren asimétricamente. - Crear unos mapas analíticos que nos permiten aislar anatómicamente sistemas macroscópicos conectados funcionalmente para, por ejemplo, diferenciar respuestas directas e indirectas (o monosinápticas vs. polisinápticas) o el estudio del problema asociado a las respuestas BOLD negativas—vid. Capítulo 14.