Resum El principal objectiu d'questa Tesi Doctoral és l'estudi de la conectividad funcional del cervell in vivo combinant imatge per ressonància magnètica funcional amb microestimulació elèctrica cerebral en animals d'experimentació. Aquesta Tesi Doctoral s'emmarca en un equip multidisciplinar fruit de l'estreta col·laboració que mantenen el Centre de Biomaterials i Enginyeria Tisular de la Universitat Politècnica de València i l'Institut de Neurociències d'Alacant del Consell Superior d'Investigacions Científiques–Universitat Miguel Hernández. L'estudi de la connectivitat funcional és de gran interés en la neurobiologia bàsica actual i una peça fonamental en la recerca preclínica d'enfermetats psiquiàtriques. No en va, es tracta del mecanisme sobre el que es fonamenten dos dels principis bàsics de la neurobiología: l'especialització i l'integració funcional. El sistema nerviós implementa un processament altament distribuït de la informació, amb mòduls especialitzats en aspectes específics del processament que es combinen entre sí de forma integral. Per exemple, l'experiència multisensorial d'un episodi quotidià s'experimenta com una percepció única (o integrada). En aquest context, la connectivitat eficient entre mòduls funcionals, o connectivitat funcional, és un requisit indispensable. Per a ésser eficient, dita connectivitat deu adaptar-se a les necessitats del sistema en un entorn –el mitjà en què es desenvolupa l'organisme– que està en continu canvi. Per tant, la configuració funcional del network és una característica dinàmica determinada pels mecanismes de plasticitat sinàptica, adaptació i modulació, que defineix el fluxe d'informació al sistema. La gran semblança entre alguns models cerebrals (com el dels micos o rates) i el cervell humà, fa que l'experimentació amb animals permeta extrapolar amb relativa senzillesa moltes de les conclusions que sobre ells es deriven. Els mètodes d'anàlisis per a l'estudi de la connectivitat funcional que aquí es presenten s'han aplicat al cas específic per a imatges de ressonància magnètica funcional de cervells de rata que s'estimulen elèctricament. Per detectar les xarxes cerebrals que es connecten funcionalment s'han utilitzat tècniques que assumeixen la correlació entre senyals hemodinàmiques cerebrals com a indicadors de la connectivitat, ja siga a partir de l'anàlisi estàndard de la correlació creuada o a partir de mesures multivariades per a la detecció de patrons de variància/covariància. Els sis primers capítols de la memòria introdueixen les bases teòriques i de coneixement que permeten el disseny i desenvolupament de tots aquells mètodes que es presenten com a eines per al nostre estudi de la connectivitat funcional. En aquesta primera part de la Tesi Doctoral s'exposen els següents conceptes clau: 1. Que la neurociència moderna es postula sobre la base de la doctrina de la neurona—una teoria que descriu al cervell humà com un sistema format per bilions d'elements discrets especialitzats en realitzar operacions molt concretes (anomenats neurones), que es connecten (a través d'unes petites connexions electroquímiques anomenades sinapsis) amb altres elements o neurones similars formant xarxes de món menut que responen de forma concreta front a families d'estímuls determinats. 2. Que una de les formes més eficients, en l'actualitat, d'estudiar la connectivitat funcional és a través de les imatges de ressonància magnètica funcional (o IRMf) i el model lineal general, el qual permet la construcció de mapes estadístics paramètrics que localitzen les regions cerebrals involucrades en una tasca cognitiva o percepció sensorial determinada. Els mapes estadístics paramètrics es construeixen sobre la base del principi de Fick i al senyal depenent del nivell d'oxigenació sanguínia o BOLD (per les seues sigles en anglès: blood-oxygen-level-dependent), la qual prediu amb un alt grau de confidència l'activitat neuronal subjacent [1]. 3. Que per a poder construir mapes estadístics paramètrics que revelen de forma efectiva l'activitat global neuronal són necessàries una sèrie d'operacions prèvies a l'anàlisi paramètrica, com són: el pre-processat de les imatges funcionals, la modelització de les correlacions serie o la normalització global—que preveu l'emmascarament de les respostes funcionals segregades. 4. Que la connectivitat funcional és un concepte estadístic a través del qual es pretén quantificar la informació mútua entre les sèries temporals d'esdeveniments neurofisiològics, i que un dels millors indicadors (o marcadors) de la connectivitat funcional és la correlació entre senyals BOLD-IRMf d'un o més vòxels que (per norma general) estan separats anatòmicament. En aquest sentit, l'assumpció connectivitat/correlació habilita multitud de tècniques de mesura que van des de les més senzilles (com les anàlisis clàssiques de correlació creuada) fins a unes altres molt més sofisticades. Entre aquestes últimes resulten molt populars les tècniques multivariades basades en la descomposició en components o coordenades principals com per exemple la descomposició en valors singulars (o SVD, per les seues sigles en anglès: single value decomposition) i la classificació no supervisada o clustering. Una vegada exposats els principis i mecanismes metodològics bàsics per a l'estudi de la connectivitat funcional, en el Capítol 7 es presenten els procediments experimentals que permeten adquirir les imatges per ressonància magnètica del cervell de rates d'experimentació. En els diferents experiments es combina l'adquisició d'imatges funcionals amb la implantació d'un (o dos) elèctrodes de microestimulació elèctrica cerebral mitjançant els quals s'aconsegueix provocar una activació neuronal controlada [2]. Totes les rates se sotmeten a un estricte protocol quirúrgic que permet col·locar amb gran precisió els elèctrodes d'estimulació en unes coordenades predeterminades i ben conegudes (fet fonamental en el disseny dels nostres mètodes d'anàlisis, donat que permet l'obtenció i discussió de gran part dels resultats que presentem). Un complement molt important (indispensable en la majoria de les nostres anàlisis) correspon a un atles anatòmic multifuncional dissenyat específicament per a l'espai anatòmic de referència de les nostres dades. La forma en què dissenyem aquest atles cerebral de rata es presenta en un capítol específic en la part de mètodes (vid. Capítol 8—Síntesis de atlas tridimensionales para el estudio de la conectividad en cerebros de rata) atès que la metodologia de disseny que presentem es va idear per a poder ser aplicada de forma genèrica per a la síntesi d'atles per a espais de referència diferents al que assumim com a propi. En quant a la resta, l'estudi de la connectivitat ho afrontem mitjançant dues vies de desenvolupament ben diferenciades, que es fonamenten en dos paradigmes d'anàlisis ortogonals però complementaris (donat què tots dos assumeixen la correlació com el marcador de la connexió neuronal): - El primer grup de mètodes mesura la connectivitat funcional segons la forma tradicional, és a dir: sobre la base d'anàlisi de la correlació creuada entre sèries temporals representatives de vòxels aïllats o grups d'ells. L'ús del nostre atles cerebral multifuncional juntament amb un procés iteratiu que calcula la correlació creuada entre tots els senyals BOLD-IRMf mitjanes de totes les regions/etiquetes actives de cert mapa estadístic paramètric permet el càlcul d'unes matrius quadrades que revelen in vivo i dinàmicament el pes de les connexions que identifiquen a cert estat funcional. Atès que la estimulació elèctrica d'un mateix nucli cerebral deu mostrar un mateix patró de modulació sinàptica (inclús assumint el possible error experimental i la variança en la resposta funcional de cada subjecte), les matrius que calculem (a les quals cridem empremptes de connectivitat) permeten el desenvolupament de tècniques de classificació de subjectes sobre la base d'estats funcionals concrets, i per tant, les agrupacions de subjectes revelen patrons d'activació neuronal (o de connectivitat funcional subjacent) reconeixedors (i per tant característics) entre els subjectes de la població analitzada (vid. Capítol 9—Huellas de conectividad y análisis de grupos). - La segona via de desenvolupament del nostre estudi de la connectivitat funcional en el cervell de rata té a veure amb la visió multivariada de les dades de IRMf a través de la seua descomposició en valors singulars. En concret, l'anàlisi multidimensional de les dades el realitzem combinant SVD i un procés de clustering. En primer lloc, realitzem una projecció SVD de les sèries de temps BOLD-IRMf coneguda com a espai funcional—un sistema mètric en el qual la distància entre qualssevol dues vòxels es relaciona amb el grau de connectivitat que existeix entre ells. En segon lloc i en virtut de l'abstracció connectivitat/distància, sotmetem a l'espai funcional a un procés de classificació no supervisada, procediment pel qual som capaços d'identificar, com a membres d'un mateix cluster, a aquells vòxels que estan connectats funcionalment entre si i, per tant, amb una resposta funcional mitjana representativa del sistema. Atès que dos vòxels pròxims en l'espai funcional poden estar segregats anatòmicament, utilitzem les agrupacions de l'espai funcional per a construir mapes multiparamètrics de la connectivitat funcional que permeten expressar la resposta funcional dels efectes neuronals globals com una suma de diversos modes hemodinàmics (vid. Capítol 10—Sistemas funcionales). Finalment, cal esmentar que totes les metodologies d'anàlisis de la connectivitat funcional dissenyades en aquesta Tesi Doctoral han sigut transcrites en desenes de funcions que, juntament amb l'atles multifuncional del cervell de rata que hem dissenyat específicament per a les nostres dades, ens permeten (a manera de resultats): 1. La creació d'un software d'elaboració pròpia per a l'anàlisi d'imatges de ressonància magnètica funcional de cervells de rata que s'estimulen elèctricament. Aquest software (al que cridem SPMrat) utilitza algunes funcions del paquet MATLAB conegut com SPM (SPM8, www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm8/) i permet de forma molt senzilla (a través de diàlegs de pregunta/resposta, funcions de fàcil invocació i interfícies gràfiques) una anàlisi integral i automàtic de les imatges funcionals per a l'estudi de la connectivitat funcional a partir del pre-processat d'imatges, l'anàlisi de grups de subjectes a partir de la classificació de les empremptes de connectivitat o l'extracció de sistemes funcionals a partir de l'anàlisi mean shift del sistema mètric de la connectivitat funcional. 2. Sintetitzar unes estructures matricials en representació de l'activitat neuronal que revelen dinàmicament el substrat anatòmic associable a un conjunt específic de connexions establides (juntament amb els seus pesos funcionals), identificant de forma única a cada subjecte aïllat a partir de l'activitat IRMf induïda. 3. Dissenyar un classificador de patrons de connectivitat funcional (és a dir, de les representacions matricials de l'apartat anterior o empremptes de connectivitat) que (al seu torn) permet la identificació dels diferents estats funcionals que puguen generar-se entre diversos subjectes als quals s'aplica un o més paradigmes d'estimulació elèctrica. 4. Implementar un procediment de classificació no supervisada mitjançant l'algorisme mean shift que és capaç d'extraure els modes d'aquella distribució estadística que representa la connexió dels supra-vòxels representats en cert espai funcional i per tant, la definició de clusters o sistemes funcionals identificables tant espacialment (a partir d'unes màscares binàries de pertinença) com temporalment (a partir dels senyals mitjans BOLD-IRMf). 5. Elaborar uns mapes multiparamètrics que permeten expresar la resposta funcional integrada en una suma de respostes funcionals parcials, fonamentalment a partir de la caracterització dispersiva de les funcions de resposta hemodinàmica segons la pròpia descomposició mean shift del pas anterior. Sobre la base d'aquests resultats, podem derivar les següents conclusions biomèdiques: - Que les empremptes de connectivitat permeten predir la posició dels elèctrodes d'estimulació i els paràmetres d'estimulació emprats per a generar les respostes funcionals. Açò suggereix que traslladar aquestes tècniques al món clínic, i en concret a les pràctiques de l'estimulació cerebral profunda, pot resultar molt beneficiós. Per exemple, pot confirmar la correcta implantació de l'elèctrode i en cas contrari, modificar el seu posicionament per a optimitzar el resultat clínic—vid. capítols 12, 13 i/o 15. - Que l'algorisme mean shift permet la descomposició de la resposta funcional integrada en diverses respostes parcials que identifiquen a grups de vòxels que estan connectats funcionalment entre sí, per la qual cosa podem: - Obtenir conclusions relatives a la causalitat o retard sistemàtic [3] de les respostes funcionals (segons el principi del repòs inicial dels sistemes lineals invariants en el temps). - Estudiar la connectivitat efectiva a partir de l'ús de dos o més elèctrodes d'estimulació les respostes evocades de la qual s'interfereixen asimètricament. - Crear uns mapes analítics que ens permeten aïllar anatòmicament sistemes macroscòpics connectats funcionalment per a, per exemple, identificar respostes directes i indirectes (o monosináptiques vs. polisináptiques) o l'estudi del problema associat a les respostes BOLD negatives—vid. Capítol 14.