El inmunosupresor FK506 (Tacrolimus, Prograf) ha incrementado la tasa de supervivencia del trasplante de órganos. FK506 ejerce su acción inmunosupresora mediante la inhibición de la fosfatasa calcineurina en células T activadas. Desgraciadamente, la terapia con FK506 está asociada con efectos no terapéuticos indeseados, entre los que destaca la diabetes, que implican otras dianas distintas de calcineurina. Para identificar estas dianas hemos estudiado la toxicidad celular de FK506 en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. FK506 aumentó la sensibilidad de la levadura a estrés osmótico de un modo independiente de calcineurina y las proteínas de unión a FK506 Fpr1p, -2p, -3p y -4p. FK506 también indujo un fuerte ayuno de aminoácidos y la activación de la ruta de control general de nutrientes (GCN) o de control traduccional. La prototrofía de triptófano o el exceso de triptófano eliminó la toxicidad de FK506, lo que muestra que el ayuno de triptófano media este efecto. La mutación de los genes GCN3 y 4 alivió parcialmente la toxicidad de FK506, lo que sugiere que la activación de la ruta GCN por FK506 también está implicada en la tolerancia osmótica. FK506 reforzó la fosforilación de la kinasa Hog1p dependiente de estrés osmótico. Esta hiperfosforilación no se vio acompañada de inducción de un reportero dependiente de Hog1p. Interesantemente, la interrupción del gen GCN2 suprimió la hiperfosforilación de Hog1p dependiente de FK506 y restauró la actividad del reportero dependiente de Hog1p. A la inversa, la interrupción del gen HOG1 afectó a la activación de Gcn2p y traducción de un reportero GCN4-lacZ dependientes de FK506. Esto pone de manifiesto la existencia de una interacción funcional entre las kinasas Gcn2p y Hog1p. En conjunto estos datos demuestran que tanto el ayuno de aminoácidos como la activación de la ruta GCN inducidos por FK506 contribuyen a la sensibilidad celular a estrés osmótico y revelan un bucle regulador positivo entre las rutas GCN y HOG. 

Dada la naturaleza conservada de estas rutas, este mecanismo de toxicidad de FK506 podría ser relevante para los efectos no terapéuticos de la terapia con este inmunosupresor. Con el fin de profundizar en este aspecto estudiamos la toxicidad de FK506 en células de mamíferos. FK506 reguló la activación de p38 por estrés osmótico, y disminuyó la viabilidad de células sometidas a este estrés. Además, el tratamiento con FK506 incrementó fuertemente, como en levadura, la fosforilación de la subunidad  alfa?del factor eucariótico de iniciación (eIF2alfa). La adición de aminoácidos al medio palió la fosforilación de eIF2alfa, la inhibición de p38 y la letalidad celular, lo que sugiere que la disponibilidad de aminoácidos media la toxicidad de FK506 también en células de mamíferos.

Uno de los efectos no terapéuticos más relevantes del FK506 es la diabetes mellitus post-trasplante. La última parte de nuestro trabajo se centró en el estudio del mecanismo de acción de una pequeña molécula moduladora de los efectos de FK506, el tungstato. Esta sal inorgánica, usada como agente antidiabético, fue capaz de rescatar el defecto de crecimiento que provoca FK506 en levadura. Este rescate es independiente de la interacción del inmunosupresor con su diana terapéutica conocida, calcineurina. Tungstato potenció la activación de la ruta GCN inducida por FK506 y exacerbó el fenotipo de sensibilidad osmótica inducido por FK506. Además, se demostró que tungstato es capaz de modular la activación de Hog1p y la expresión génica Hog1p-dependiente, aunque sin causar un fenotipo observable. El hecho de que la inducción de la ruta GCN por tungstato sólo se produzca en presencia de otro inductor sugiere la modulación de un regulador de la ruta. Tungstato fue capaz de inhibir in vitro a la fosfatasa Glc7p, regulador negativo de la ruta GCN, y a su ortólogo mamífero PP1. Además, un mutante con baja actividad Glc7p mimetizó la resistencia a FK506 que produce tungstato y los datos de interacción genética con el mutante gcn2-507 son consistentes con una inhibición in vivo de la fosfatasa. Por otro lado, tungstato produce en la levadura fenotipos relacionados con la homeostasis iónica. En este efecto de tungstato podrían estar implicadas tanto Glc7p como la fosfatasa Ppz1p, a la que tungstato inhibe in vitro, como la propia ruta GCN, cuya activación constitutiva demostró tener efectos en la regulación iónica celular.