L’immunosupressor FK506 (Tacrolimus, Prograf) ha incrementat la taxa de supervivència del trasplantament d’òrgans. FK506 exerceix la seua acció immunosupressora mitjançant la inhibició de la fosfatassa calcineurina en cèl•lules T activades. Desgraciadament, la teràpia amb FK506 està associada amb efectes no terapèutics indesitjats, entre els quals destaca la diabetis, que impliquen altres dianes  distintes de calcineurina. Per a identificar aquestes dianes hem estudiat la toxicitat cel•lular de FK506 en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. FK506 va augmentar la sensibilitat del llevat a l’estrés osmòtic d’una manera independent de calcineurina i les proteïnes d’unió a FK506 Fpr1p, -2p, -3p i -4p. FK506 també va induir un fort dejuni d’aminoàcids i l’activació de la ruta de control general de nutrients (GCN) o de control traduccional. La prototrofia de triptòfan o l’excés de triptòfan va eliminar la toxicitat de FK506, la qual cosa mostra que el dejuni de triptòfan intervé en aquest efecte. La mutació dels gens GCN3 i 4 va alleujar parcialment la toxicitat de FK506, la qual cosa suggereix que l’activació de la ruta GCN per FK506 també està implicada en la tolerància osmòtica. FK506 va reforçar la fosforilació de la kinassa Hog1p dependent d’estrés osmòtic. Aquesta hiperforforilació no es va a veure acompanyada d’inducció d’un reporter dependent d’Hog1p. De manera interessant, la interrupció del gen GCN2 va suprimir l’hiperfosforilació d’Hog1p dependent de FK506 i va restaurar l’activitat del reporter dependent de Hog1p. Al revés, la interrupció del gen HOG1 va afectar l’activació de Gcn2p i la traducció d’un reporter GCN4-lacZ dependents de FK506. Açò posa de manifest l’existència d’una interacció funcional entre les kinases Gcn2p i Hog1p. En conjunt, aquestes dades demostren que tant el dejuni d’aminoàcids com l’activació de la ruta GCN induïts per FK506 contribueixen a la sensibilitat cel•lular a estrés osmòtic, i revelen un bucle regulador positiu entre les rutes GCN i HOG.

Donada la naturalesa conservada d’aquestes rutes, aquest mecanisme de toxicitat de FK506 podria ser rellevant per als efectes no terapèutics de la teràpia amb aquest immunosupressor. A fi d’aprofundir en aquest aspecte estudiem la toxicitat de FK506 en cèl•lules de mamífers. FK506 va regular l’activació de p38 per estrés osmòtic, i va disminuir la viabilitat de cè•lules sotmeses a aquest estrés. A més, el tractament amb FK506 va incrementar notablement, com en el cas del llevat, la fosforilació de la subunitat alfa del factor eucariòtic d’iniciació (eIF2alfa). L’addicció d’aminoàcids al medi va pal•liar la fosforilació d’eIF2alfa, la inhibició de p38 i la letalitat cel•lular, la qual cosa suggereix que la disponibilitat d’aminoàcids intervé en la toxicitat de FK506 també en cèl•lules de mamífers.

Un dels efectes no terapèutics més rellevants del FK506 és la diabetis mellitus post-trasplantament. L’última part del nostre treball es va centrar en l’estudi del mecanisme d’acció d’una xicoteta molècula moduladora dels efectes de FK506, el tungstat. Aquesta sal inorgànica, utilitzada com agent antidiabètic, va ser capaç de rescatar el defecte de creixement que provoca FK506 en llevat. Aquest rescat és independent de la interacció de l’immunosupressor amb la seua diana terapèutica coneguda, calcineurina. Tungstat va potenciar l’activació de la ruta GCN induïda per FK506 i va exacerbar el fenotip de sensibilitat osmòtica induït per FK506. A més, es va demostrar que tungstat és capaç de modular l’activació d’Hog1p i l’expressió gènica Hog1p-dependent, malgrat que no va causar un fenotip observable. El fet de que la inducció de la ruta GCN per tungstat només es produeixca en presència d’un altre inductor suggereix la modulació d’un regulador de la ruta. Tungstat va ser capaç d’inhibir in vitro a la fosfatassa Glc7p, regulador negatiu de la ruta GCN, i al seu ortòleg mamífer PP1. A més, un mutant amb baixa activitat Glc7p va mimetitzar la resistència a FK506 que produeix tungstat i les dades d’interacció genètica amb el mutant gcn2-507 son consistents amb una inhibició in vivo de la fosfatassa. D’altra banda, tungstat produeix en el llevat fenotips relacionats amb la homeostasis iònica. En aquest efecte de tungstat podrien estar implicades tant Glc7p com la fosfatassa Ppz1p, a la que tungstat inhibeix in vitro, com la pròpia ruta GCN, de la qual l’activació constitutiva va demostrar tenir efectes en la regulació iònica cel•lular