Resumen La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche puede ocasionar problemas desde el punto de vista de la salud pública (alergias, trastornos digestivos, resistencias a medicamentos, etc.), además de ser la causa de interferencias en determinados procesos de fermentación de la industria láctea. Por ello resulta necesario establecer medidas de control que aseguren que la leche se encuentra libre de residuos y que cumple la legislación europea. Ante la posible falta de fiabilidad de los métodos para la detección de inhibidores en la leche de oveja, el escaso número de trabajos efectuados en esta especie y los inconvenientes que originan la presencia de sustancias inhibidoras, tanto en los consumidores como para los procesos tecnológicos, se planteó la necesidad de realizar un estudio sobre un método específico de cribado o "screening" para la detección de inhibidores (Eclipse( "100ov"), así como la aplicación de una técnica microbiológica mutiplaca o multirresiduo (Sistema Microbiológico Multiplaca-SMMP) para la confirmación e identificación preliminar de residuos de antimicrobianos en la leche de oveja. El método Eclipse(, es una técnica microbiológica de difusión en agar, en el que se encuentran esporas de Bacillus stearothermophilus var calidolactis C953, con un indicador ácido-base. La leche se coloca en los pocillos de la microplaca y tras la incubación, se procede a la interpretación del resultado. En el caso de que la leche no contenga residuos de inhibidores, se producirá el desarrollo del microorganismo y aparecerá un cambio en la coloración del indicador ácido-base presente en el medio, que del color azul inicial pasará al amarillo. Mientras que si existen inhibidores no se manifestará el cambio de coloración. El "Sistema Microbiológico Multiplaca" o multirresiduo (SMMP) es un método microbiológico que detecta de una forma selectiva la presencia de residuos de diferentes grupos de antimicrobianos en la leche. La muestra es analizada a través de distintas placas de Petri con una composición determinada, a fin de optimizar las condiciones de crecimiento de los microorganismo. De este modo se emplean, B. Stearothermophilus var. calidolactis C953 (betalactámicos), B. subtilis BGA a pH 8,0 (aminoglucósidos), M. luteus ATCC 9341 (macrólidos), E. coli ATCC 11303 (quinolonas), B. cereus ATCC 11778 (tetraciclinas) y B. subtilis BGA, a pH 7,0 (sulfonamidas). La presencia de residuos de antimicrobianos se manifiesta por la aparición de una zona de inhibición del crecimiento microbiano. Los experimentos se han realizado sobre un total de 27 sustancias antimicrobianas pertenecientes a los grupos de betalactámicos (penicilina G, amoxicilina, cloxacilina, oxacilina, cefalexina, cefadroxil, cefoperazone y cefuroxime), aminoglucósidos (gentamicina, kanamicina, neomicina y estreptomicina), macrólidos (eritromicina, espiramicina y tilosina), quinolonas (ciprofloxacina, enrofloxacina, flumequina y norfloxacina), tetraciclinas (clortetraciclina, doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina) y sulfonamidas (sulfadimetoxina, sulfametacina, sulfanilamida y sulfatiazol). Para llevar a cabo estos ensayos, se emplearon muestras de leche de oveja procedentes de animales sanos, no tratados con ninguna sustancia medicamentosa y que presentaban una adecuada composición química y calidad higiénico-sanitaria Los parámetros que se han evaluado, en los dos métodos, han sido por una parte la especificidad, bien mediante el estudio de la selectividad, que indica la presencia de resultados "falsos positivos" y en el caso del SMMP también se ha incluido un estudio de la especificidad cruzada a fin de analizar la influencia de los antimicrobianos estudiados en las diferentes placas no destinadas a su determinación. Por otro lado se han calculado en ambos métodos los límites de detección y su comparación con los Limites Máximos de Residuos (LMR) marcados por la legislación europea. Respecto al método Eclipse( "100ov", hay que señalar que en ningún caso se presentaron resultados positivos ("falsos positivos"). La relación de selectividad para el método Eclipse(r) "100ov" durante todo el experimento resultó muy elevada siendo de 0,99 % para el caso de muestras sin conservante y de 0,91 % para aquellas que contenían azidiol, lo que indica la interferencia de este conservante en el análisis de inhibidores en la leche. Los límites de detección de los antimicrobianos ensayados mediante la técnica Eclipse "100ov", han resultado cercanos a los LMRs establecidos por la UE, siendo estos de: 5 penicilina "G", 7 (g/kg amoxicilina, 68 (g/kg cloxaciclina, 28 (g/kg oxacilina, 115 (g/kg cefalexina, 110 (g/kg cefoperazone, 170 (g/kg sulfadimetoxina y 250 (g/kg sulfatiazol. Sin embargo para el resto de sustancias ensayadas los límites de detección se alejan bastante de sus respectivos LMR. En cuanto al SMMP en la leche de oveja, las ecuaciones de regresión que relacionan la concentración y la medida de la zona de inhibición del crecimiento microbiano presentan en todos los casos elevados coeficientes de regresión (0,9719-0,9995). Esto señala una gran linealidad en la respuesta y la posibilidad de establecer un diámetro o "nivel de decisión" a concentraciones próximas a los LMR establecidos. Los diámetros de la zona de inhibición considerados como niveles de decisión para los diferentes grupos de antimicrobianos han sido: 20 mm para los betalactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, tetraciclinas y sulfonamidas, y de 22 mm en el caso de las quinolonas. La especificidad del SMMP se evaluó a través de la selectividad que resultó muy elevada 98-100% y de la especificad cruzada. En el estudio de esta última se observaron interferencias significativas en el caso de la placa destinada a la determinación de betalactámicos por antibióticos del grupo de los aminoglucósidos y los macrólidos, resaltando especialmente la tilosina, que para todas las concentraciones presentó un diámetro de inhibición superior a 24 mm. En el resto de placas la especificidad fue buena, presentándose pequeñas interferencias a elevadas concentraciones de algunos de los antibióticos. De un modo general, se puede concluir que los métodos estudiados son válidos, en especial para el análisis de betalactámicos y sulfonamidas, por lo que podrían ser utilizados en el análisis de cribado, así como en la confirmación e identificación de residuos de antibióticos en la leche de oveja. Aunque es conveniente señalar que se considera necesario continuar y profundizar en el estudio de los métodos de detección de residuos de antimicrobianos en la leche, así como en el desarrollo de nuevos métodos con mayor sensibilidad que permitan a los laboratorios de control de calidad y a las industrias lácteas disponer de una herramienta eficaz para evitar la llegada de residuos de medicamentos al consumidor y asegurar el cumplimiento de la legislación vigente.