Resumen
   Los viroides, los agentes infecciosos conocidos más simples, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario. A pesar de su pequeño tamaño (246-401 nt) y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en ciertas plantas. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de dos metodologías para el control de viroides basadas en ribozimas de cabeza de martillo con motivos de estabilización terciaria, y en RNAs interferentes que inducen en la planta una respuesta defensiva de silenciamiento génico mediado por RNA.
   Las ribozimas derivadas del viroide latente de la berenjena (Eggplant latent viroid, ELVd), que en su contexto natural median el autocorte de los RNAs multiméricos generados por un mecanismo de replicación de círculo rodante, son particularmente interesantes para adaptarlas a un formato trans. Hemos observado que la secuencia del trinucleótido que precede el sitio de autocorte de la ribozima de polaridad (+) del ELVd afecta a su actividad autocatalítica. Las constantes catalíticas de distintas variantes de este trinucleótido (AUA, AUC, GUA, GUC) determinadas in vitro a baja concentración de magnesio son diferentes en condiciones co- y postranscripcionales. Estos resultados sugieren que la ribozima de polaridad (+) del ELVd, y muy posiblemente otras ribozimas de cabeza de martillo naturales, han sido evolutivamente seleccionadas para actuar durante la transcripción de los RNAs viroidales, y que el trinucleótido AUC que precede al sitio de autocorte no se encuentra en la mayoría de las ribozimas de cabeza de martillo naturales por favorecer la adopción de estructuras metaestables catalíticamente inactivas durante la transcripción. La variante ELVd(+)-GUC, que presenta una constante catalítica alta e induce el corte de una amplia fracción del transcrito primario, fue seleccionada para diseñar variantes en trans frente al viroide del tubérculo fusiforme de la patata (Potato spindle tuber viroid, PSTVd).
   Varias ribozimas de cabeza de martillo, con formato trans discontinuo o extendido y motivos de estabilización terciaria derivadas de las ribozimas de polaridad (+) del ELVd y (-) del viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd), catalizan in vitro a concentraciones fisiológicas de magnesio la degradación específica de un RNA muy estructurado de 464 nt del PSTVd. La variante más eficiente resultó ser una ribozima con formato extendido basada en la de polaridad (-) del PLMVd. Experimentos de agroinfiltración en N. benthamiana, en los que se coagroinfiltran plásmidos recombinantes que expresan esta última variante y un RNA sustrato del PSTVd mostraron una reducción en la acumulación del mismo en las hojas infiltradas respecto a un control con una ribozima similar pero sin motivos de estabilización terciaria. Cuando la ribozima estabilizada se coexpresó con un RNA infeccioso del PSTVd retrasó la acumulación de las formas genómicas viroidales en las hojas superiores no infiltradas.
   Por último, la coinoculación mecánica de RNAs genómicos viroidales con un exceso de RNAs bicatenarios (dsRNAs) homólogos indujo una reducción significativa de la infectividad en cuatro sistemas distintos [viroide de la exocortis de los cítricos (Citrus exocortis viroid, CEVd)-gynura, CEVd-tomate, PSTVd-tomate y viroide del moteado clorótico del crisantemo (Chrysanthemum chlorotic mottle viroid, CChMVd)-crisantemo] que incluyen a miembros de las dos familias de viroides. Los efectos fueron específicos de secuencia, dependientes de la temperatura de cultivo de las plantas y, en algún caso, de la dosis de dsRNAs. En los sistemas CEVd-gynura y CEVd-tomate se observó un efecto similar al coinocular el viroide con un exceso de pequeños RNAs viroidales generados in vitro. Además, la coagroinfiltración de plásmidos recombinantes que expresan un RNA infeccioso del PSTVd y un RNA homólogo con plegamiento en horquilla (generado a partir de una construcción con secuencias del PSTVd invertidas separadas por un intrón) retrasó la acumulación del viroide en las hojas infiltradas y en las superiores no infiltradas. La especificidad de la protección obtenida con estas dos estrategias (coinoculación con dsRNAs y expresión transitoria de RNAs con plegamiento en horquilla) sugiere que en ciertas condiciones los viroides son dianas de RISC.