“Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV)” Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe todavía un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. Es importante destacar que el bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus. Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)-?cp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz de acentuar la sintomatología. Asimismo, ensayos de expresión transitoria de cada una de las ORFs del virus han puesto de manifiesto la capacidad de las proteínas 7B y CP para suprimir el silenciamiento génico de RNA, favoreciendo esta última el movimiento local del virus. Una vez determinadas las funciones de cada una de las proteínas codificadas por el MNSV se inició un estudio sobre la estrategia que utiliza este patógeno en su movimiento intra- e intercelular. Como primera aproximación, en el Capítulo 2 se abordó un estudio bioquímico y estructural de las MPs del MNSV. Las proteínas de movimiento de los Carmovirus presentan una serie de características comunes a nivel de estructura secundaria que podrían ser la base de su similitud funcional. La p7A es una proteína rica en aminoácidos básicos e hidrofílicos que une preferentemente RNA de simple cadena de forma cooperativa y sin especificidad de secuencia aparente. Sin embargo, a diferencia de la p7 del Virus del moteado del clavel, en la que la función recae sobre el dominio central estructurado en ?-hélice, se ha demostrado que toda la secuencia de p7A está implicada en la unión, con una mayor participación de la región central en el proceso. Así, el péptido sintético correspondiente a la secuencia de la región central de p7A y estructurado en ?-hélice, es capaz de unir RNA aunque con una constante de disociación (Kd) significativamente mayor a la de la proteína entera (9mM vs 25,7?M). Por otro lado, la p7B se comporta como una proteína integral de membrana cuando es expresada en un sistema de transcripción/traducción in vitro en presencia de microsomas caninos derivados del RE. Posteriormente, se ensayó in vivo una colección de mutantes que afectan a diferentes propiedades estructurales de las MPs del MNSV. En el caso de la p7A, este estudio ha puesto de manifiesto que los residuos básicos, especialmente aquellos situados en la región central de la proteína, están directamente implicados en el movimiento local del virus, existiendo una relación directa entre la presencia o no de dichos residuos y la capacidad de unión a RNA de la p7A. Por otro lado, la disminución del perfil hidrofóbico de p7B, la desestructuración de la ?-hélice del fragmento transmembrana, así como la modificación tanto de los aminoácidos aromáticos como del balance de cargas a ambos lados de este dominio hidrofóbico, repercuten negativamente en el movimiento célula a célula del MNSV. Por último, con la finalidad de obtener información sobre la ruta intracelular de este patógeno, se ha estudiado el patrón de localización subcelular de las MPs del MNSV. Para abordar este estudio se han obtenido construcciones recombinantes de la p7A y la p7B con las proteínas fluorescentes GFP o RFP. Éstas se ensayaron in vivo en plantas de N. benthamiana y en presencia de marcadores de orgánulos celulares. El patrón de distribución subcelular de p7B muestra un dinamismo espacio-temporal que, dadas sus propiedades hidrofóbicas, coincide siempre con compartimentos membranosos de la célula. Inicialmente, la p7B se localiza en la red cortical del retículo endoplasmático (RE) y la membrana externa del núcleo. Posteriormente, la proteína forma parte de partículas móviles que se han identificado como dictiosomas del aparato de Golgi. Éstos se desplazan por el citoplasma de la célula mediante los microfilamentos de actina/miosina. Por último, la p7B se localiza en los plasmodesmos (PD). Por otro lado, aunque la p7A presenta características de proteína soluble, ésta forma agregados en el citoplasma de la célula, asimismo, también es capaz de unirse a los dictiosomas del aparato de Golgi y a los PD. La ausencia de otros factores virales no modifica el patrón de distribución subcelular de p7A, por lo que, dadas las propiedades de esta proteína, algún factor celular debe estar implicado en el mismo. Respecto la p7B, el tratamiento con Brefeldina A, un inhibidor de la ruta secretora, impide la salida de esta proteína al aparato de Golgi, quedando retenida en el RE y no llegando a los PD. Este resultado muestra que ésta podría ser la ruta utilizada por la misma para alcanzar la periferia de la célula durante una infección. Asimismo, la localización subcelular de diferentes formas mutantes de la p7B en las que se han modificado alguno de los determinantes de topología, hidrofobicidad e inserción a membrana de la misma, muestran una clara correlación entre movimiento célula a célula del MNSV y su patrón de distribución subcelular. De este modo, se ha establecido que cuando p7B no se localiza en los dictiosomas del aparato de Golgi el virus no es capaz de moverse célula a célula. Por último, el avance de la infección viral se ve drásticamente reducido en presencia de BrA, sugiriendo la implicación de la ruta de secreción en el transporte intra e intercelular del virus. Los datos obtenidos en la presente Tesis han permitido la propuesta de un modelo de movimiento intracelular para los Carmovirus, en el que está implicada la ruta secretora a través del aparato de Golgi. Esta es la primera vez que este mecanismo se describe para un sistema de movimiento de virus de plantas. ?? ?? ?? ?? Resumen______________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________Resumen