“Anàlisi funcional i localització subcel?lular de les proteïnes implicades en el moviment intra i intercel?lular del virus de les taques necròtiques del meló (MNSV)”. Els virus de plantes constitueixen, de vegades, una seria amenaça per a molts cultius. A pesar de les nombroses investigacions realitzades, existeix encara un gran desconeixement de les rutes i els mecanismes que operen en la invasió viral dels corresponents hostes. És important destacar que el bloqueig en el moviment viral constituïx un dels mecanismes de resistència natural més freqüents als virus. El progrés en el coneixement d'aquestes etapes del cicle viral pot dur a estratègies antivirals. En el present treball s'ha pretès caracteritzar estructural i funcionalment les 5 proteïnes codificades pel genoma del MNSV, fent especial èmfasi a caracteritzar els factors, tant virals com cel·lulars, que intervenen en el transport intra i intercelular del virus. Com pas previ i necessari, en el Capítol 1 de la present Tesi, s'ha obtingut un clon infecciós del MNSV, denominat pMNSV(Al), a partir del qual es poden generar transcrits in vitro capaços de reproduir la mateixa sintomatologia que el virus després de la inoculació mecànica sobre l'hoste natural (meló). Aquest clon infecciós constituïx una eina molecular indispensable que ha permès realitzar una anàlisi funcional dels gens virals. Així, mitjançant tècniques de mutagénesi dirigida sobre el clon pMNSV(Al), s'ha obtingut una col·lecció de mutants que impedeixen l'expressió de cadascuna de les ORFs del genoma del virus. A més, les mateixes modificacions s'han efectuat sobre un clon quimèric, pMNSV(Al)-?cp-GFP, en el qual s'ha substituït la ORF que codifica la CP viral pel gen testimoni de la proteïna de fluorescència verda (GFP). Els resultats obtinguts posen de manifest que les proteïnes 29 i 89 estarien implicades en la replicació del genoma. D'altra banda, la p7A i la p7B participarien en el moviment cèl·lula a cèl·lula del virus. Finalment, p42 o CP, a més del seu paper estructural, és necessària per a la invasió sistèmica del virus, sent capaç d'accentuar la sintomatologia. Així mateix, assajos d'expressió transitòria de cadascuna de les ORFs del virus han posat de manifest la capacitat de les proteïnes 7B i CP per a suprimir el silenciament gènic de RNA, afavorint aquesta última el moviment local del virus. Una vegada determinades les funcions de cadascuna de les proteïnes codificades pel MNSV es va iniciar un estudi sobre l'estratègia que utilitza aquest patogen en el seu moviment intra- i intercelular. Com primera aproximació, en el Capítol 2 es va abordar un estudi bioquímic i estructural de les MPs del MNSV. Les proteïnes de moviment dels Carmovirus presenten una sèrie de característiques comunes a nivell d'estructura secundària que podrien ser la base de la seua similitud funcional. La p7A és una proteïna rica en aminoàcids bàsics i hidrofílics que uneix preferentment RNA de simple cadena de forma cooperativa i sense especificitat de seqüència aparent. No obstant això, a diferència de la p7 del virus del motejat del clavell, en la qual la funció recau sobre el domini central estructurat en ?-hèlix, s'ha demostrat que tota la seqüència de p7A està implicada en la unió, amb una major participació de la regió central en el procés. Així, el pèptid sintètic corresponent a la seqüència de la regió central de p7A i estructurat en ?-hèlix, és capaç d'unir RNA encara que amb una constant de dissociació (Kd) significativament major a la de la proteïna sencera (9mM vs 25,7?M). D'altra banda, la p7B es comporta com una proteïna integral de membrana quan és expressada en un sistema de transcripció/traducció in vitro en presència de microsomes canins derivats del RE. Posteriorment, es va assajar in vivo una col·lecció de mutants que afecten a diferents propietats estructurals de les MPs del MNSV. En el cas de la p7A, aquest estudi ha posat de manifest que els residus bàsics, especialment aquells situats en la regió central de la proteïna, estan directament implicats en el moviment local del virus, existint una relació directa entre la presència o no d'aquests residus i la capacitat d'unió a RNA de la p7A. D'altra banda, la disminució del perfil hidrofòbic de p7B, la desestructuració de la ?-hèlix del fragment transmembrana, així com la modificació tant dels aminoàcids aromàtics com del balanç de càrregues a banda i banda d'aquest domini hidrofòbic, repercuteixen negativament en el moviment cèl·lula a cèl·lula del MNSV. Finalment, amb l’objectiu d'obtenir informació sobre la ruta intracel·lular d'aquest patogen, s'ha estudiat el patró de localització subcelular de les MPs del MNSV. Per a abordar aquest estudi s'han obtingut construccions recombinants de la p7A i la p7B amb les proteïnes fluorescents GFP o RFP. Aquestes es van assajar in vivo en plantes de N. benthamiana i en presència de marcadors d’orgànuls cel·lulars. El patró de distribució subcelular de p7B mostra un dinamisme espai-temporal que, donades les seves propietats hidrofòbiques, coincideix sempre amb compartiments membranosos de la cèl·lula. Inicialment, la p7B es localitza en la xarxa cortical del reticle endoplasmàtic (RE) i la membrana externa del nucli. Posteriorment, la proteïna forma part de partícules mòbils que s'han identificat com dictiosomes de l'aparell de Golgi. Aquests es desplacen pel citoplasma de la cèl·lula mitjançant els microfilaments d’actina/miosina. Finalment, la p7B es localitza en els plasmodesmes (PD). D'altra banda, encara que la p7A presenta característiques de proteïna soluble, aquesta forma agregats en el citoplasma de la cèl·lula, així mateix, també és capaç d'unir-se als dictiosomes de l'aparell de Golgi i als PD. L'absència d'altres factors virals no modifica el patró de distribució subcelular de p7A, pel que, donades les propietats d'aquesta proteïna, algun factor cel·lular ha d'estar implicat en el mateix. Respecte a la p7B, el tractament amb Brefeldina A, un inhibidor de la ruta secretora, impedeix la sortida d'aquesta proteïna a l'aparell de Golgi, quedant retinguda en el RE i no arribant als PD. Aquest resultat mostra que aquesta podria ser la ruta utilitzada per la mateixa per a arribar a la perifèria de la cèl·lula durant una infecció. Així mateix, la localització subcelular de diferents formes mutants de la p7B en les quals s'han modificat algun dels determinants de topologia, hidrofobicitat i inserció a membrana de la mateixa, mostren una clara correlació entre moviment cèl·lula a cèl·lula del MNSV i el seu patró de distribució subcelular. D'aquesta manera, s'ha establert que quan p7B no es localitza en els dictiosomes de l'aparell de Golgi el virus no és capaç de moure's cèl·lula a cèl·lula. Finalment, l'avanç de la infecció viral es veu dràsticament reduït en presència de BrA, suggerint la implicació de la ruta de secreció en el transport intra i intercelular del virus. Les dades obtingudes en la present Tesi han permès la proposta d'un model de moviment intracel·lular per als Carmovirus, en el qual està implicada la ruta secretora a través de l'aparell de Golgi. Aquesta és la primera vegada que aquest mecanisme es descriu per a un sistema de moviment de virus de plantes. ?? ?? ?? ?? Resumen______________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________Resumen