ÍNDICE I.-INTRODUCCIÓN 1 1.-ACTINOMICETOS 1 1.1.-Revisión histórica de los Actinomicetos 2 1.2.-Actinomicetos nocardioformes 3 1.3.-Clasificación actual: phylum y Clase Actinobacteria 4 1.4.-Suborden Corynebacterineae 6 1.4.1.-Familia Corynebacteraceae 6 1.4.2.-Familia Dietziaceae 8 1.4.3.-Familia Gordoniaceae 9 1.4.3.1.- Género Gordonia 9 1.4.3.2.- Género Skermania 11 1.4.4.-Familia Mycobaceriaceae 12 1.4.5.-Familia Nocardiaceae 14 1.4.5.1.- Género Nocardia 14 1.4.5.2.- Género Rhodococcus 16 1.4.6.-Familia Tsukamurellaceae 18 1.4.7.-Familia Williamsiaceae 18 2.-DEPURACIÓN DE AGUAS RESIDUALES 19 2.1.-Sistema de fangos activos 19 2.2.-El flóculo 20 2.3.-Composición de la microbiota 22 2.4.-Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos 22 2.4.1.-Tasa de crecimiento 23 2.4.2.-Tolerancia a factores abióticos y toxinas 23 2.4.3.-Capacidad para contribuir a la formación del flóculo 24 3.-PROBLEMAS EN SISTEMAS DE FANGOS ACTIVOS PRODUCIDOS POR ACTINOMICETOS 24 3.1.-Formación de espumas biológicas (foaming) y aumento de volumen de los sólidos sedimentables (bulking) 24 3.2.-Microorganismos productores de espumas 27 3.2.1.-Factores que dan lugar a la formación de espumas 30 3.2.1.1.-Burbujas de aire 31 3.2.1.2.-Partículas hidrofóbicas 31 3.2.1.3.-Tensioactivos 33 3.2.2.-Factores que inciden en el crecimiento de los actinomicetos formadores de espuma 34 3.2.2.1.-Requisitos nutricionales 34 3.2.2.2.-Requisitos de oxígeno 35 3.2.2.3.-Temperatura 35 3.2.2.4.-pH 36 3.3.-Métodos de control 36 3.3.1.-Manipulación de la edad del fango 36 3.3.2.-Cloración 37 3.3.3.-Empleo de selectores 37 3.3.4.-Eliminación física 37 3.3.5.-Otros métodos 38 4.-DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE MYCOLATA EN FANGOS ACTIVOS 39 4.1.-Aislamiento y recuento 39 4.1.1.-Observación microscópica directa 39 4.1.2.-Recuento en placa 40 4.1.3.-Micromanipulación 41 4.2.-Identificación y caracterización 42 4.2.1.-Métodos clásicos 42 4.2.1.1.-Caracteres morfológicos 42 4.2.1.2.- Quimiotaxonomía 43 4.2.2.-Métodos fenotípicos 46 4.2.2.1.-Sistemas miniaturizados 47 4.2.3.-Métodos genotípicos 49 4.2.3.1.-Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 49 4.2.3.2.-PCR-RFLP 52 4.2.3.3.-Hibridación “in situ” con sondas marcadas con fluorocromos (FISH) 53 II.- OBJETIVOS 57 III.-MATERIAL Y MÉTODOS 1.-Cepas bacterianas de referencia 59 2.-Caracterización de las cepas fenotípicamente 59 2.1.-Sistemas miniaturizados API ZYM y API ID 32C 59 2.2.-Microlog (Biolog, Inc. USA) 61 3.-Detección de ácidos micólicos 64 4.-Preparación de muestras para el microscopio electrónico 65 4.1.-Fijación de células 65 4.2.-Preparación 66 5.-Caracterización de las cepas genotípicamente 66 5.1.-Extracción de DNA 66 5.2.-Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 68 5.2.1.- Nocardia 68 5.2.2.-Amplificación del gen de la proteína HSP y análisis con enzimas de restricción (PCR-RFLP-HSP) 70 5.2.3.-Gordonia 71 5.2.4.-Rhodococcus 72 6.-Hibridación con sondas fluorescentes (FISH) 76 6.1.-Diseño y elección de sondas 76 6.2.-Fijación y permeabilización de las cepas de referencia 77 6.3.-Hibridación in situ 79 6.3.1.-Observación al microscopio de epifluorescencia 81 6.3.2.-Análisis de imagen de la señal de hibridación 81 6.4.-Tinción DAPI 82 7.-Estudio de muestras de fangos activos 83 7.1.-Toma de muestras 83 7.2.-Observación microscópica 85 7.3.-Detección directa por FISH 85 7.3.1.-Técnica de enriquecimiento 86 7.4.-Puesta a punto de un método de aislamiento 86 7.4.1.-Descontaminación de las muestras 86 7.4.1.1.-Tratamiento con cloruro de benzalconio 87 7.4.1.2.-Tratamiento con NaOH 91 7.4.1.3.-Tratamiento con N-Acetil-L-Cisteína (NALC) 91 7.4.2.-Selección de medios de cultivo 91 7.4.3.-Aislamiento y recuento 93 7.5.-Caracterización de aislados fenotípicamente 93 7.6.-Caracterización de aislados genotípicamente 94 IV.-RESULTADOS 97 1.-Caracterización de las cepas de referencia fenotípicamente 97 1.1.-Sistemas API ZYM y API ID 32C 97 1.2.-Sistema MicroLog (Biolog, Inc. USA) 104 1.3.-Ácidos micólicos 109 1.4.-Observación de cepas al Microscopio electrónico 110 2.-Caracterización de cepas de referencia genotípicamente 112 2.1.-Extracción de DNA 112 2.2.- Nocardia 114 2.3.-PCR-RFLP de la proteína de estrés térmico (HSP) 116 2.4.-Gordonia 118 2.5.-Rhodococcus 121 3.-Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) en cepas de referencia 124 3.1.-Optimización de la permeabilización de mycolata 124 3.1.1.-Hibridación según el protocolo de los Reyes 124 3.1.2.-Hibridación según el protocolo de Carr 131 3.1.3.-Análisis de la señal de hibridación y tratamiento estadístico 137 4.-Puesta a punto de un método de aislamiento 142 4.1.-Selección de medios de cultivo 142 4.2.-Descontaminación previa de las muestras 144 4.3.-Aislados obtenidos 148 5.-Caracterización de aislados 154 5.1.-Fenotípicamente 154 5.1.1.- Nocardia 154 5.1.2.- Gordonia 155 5.1.3.- Rhodococcus 157 5.1.4.- Mycobacterium 158 5.1.5.- Corynebacterium 158 5.2.-Genotípicamente 159 5.2.1.-Nocardia 159 5.2.2.- Gordonia 161 5.2.3.-Rhodococcus 162 6.-Detección de mycolata por FISH 164 6.1.-Técnica de enriquecimiento de muestras ambientales 164 6.2.-Detección por FISH en muestras ambientales sin enriquecimiento 165 6.3.-Detección por FISH de aislados en cultivo puro 171 V.-DISCUSIÓN 177 VI.-CONCLUSIÓN 185 VII.-BIBLIOGRAFIA 187 VIII.-ANEJOS ANEJO I: Medios de cultivo 215 ANEJO II: Reactivos para biología molecular 219 ANEJO III: Abreviaturas empleadas 223 ANEJO IV: Reactivos para microscopía electrónica 225 ANEJO V: Direcciones de internet 227 ANEJO VI: Esquema de plantas depuradoras estudiadas 229 IX.- ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Actinomicetos nocardioformes incluidos en el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 4. 1989. 3 Tabla 2: Actinomicetos que contienen ácidos micólicos (mycolata) incluidos en el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9ª Ed.1994.4 Tabla 3: Clasificación jerárquica de la clase Actinobacteria, subclase Actinobacteridae, orden Actinomycetales basada en las secuencias de DNA y RNA ribosómico 16S (Stackebrandt et al., 1997) 5 Tabla 4: Microorganismos dominantes en las espumas de fangos activos identificados por microscopía 28 Tabla 5: Tipos de pared celular según sus constituyentes mayoritarios (Lechevalier y Lechevalier, 1980) 44 Tabla 6: Tipos de pared celular y tipos glucídicos de los actinomicetos aerobios con meso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980) 44 Tabla 7: Cepas de referencia utilizadas 60 Tabla 8: Condiciones de cultivo utilizadas con el sistema Microlog 63 Tabla 9: Solución de hibridación según las cantidades de formamida empleadas en este estudio (Anejo II) 79 Tabla 10: Sondas utilizadas en este estudio y su porcentaje de formamida 80 Tabla 11: Solución de lavado según el porcentaje de formamida (Anejo II) 81 Tabla 12: Plantas muestreadas, volumen de agua residual tratado, número de muestreos y cepas aisladas de mycolata 83 Tabla 13: Perfil enzimático obtenido con el sistema API ZYM de las cepas de referencia 98 Tabla 14: Asimilación de fuentes de carbono obtenido con el sistema API ID32C de las cepas de referencia 101 Tabla 15: Perfil numérico obtenido con el sistema API ID32C de las cepas de referencia 103 Tabla 16: Perfil bioquímico de las cepas de referencia obtenido con el sistema Microlog 105 Tabla 17: Comparación de la medida de intensidad entre los protocolos de Reyes y Carr utilizando la sonda EUB 338 139 Tabla 18: Comparación de la medida de intensidad entre los protocolos de Reyes y Carr utilizando la sonda 657 139 Tabla 19: Comparación de la medida de intensidad entre los protocolos de Reyes y Carr utilizando la sonda 736 139 Tabla 20: Comparación de la medida de intensidad entre las sondas EUB y 657 utilizando el protocolo de Reyes 141 Tabla 21: Comparación de la medida de intensidad estre las sondas EUB y 736 utilizando el protocolo de Reyes 141 Tabla 22: Comparación de la medida de intensidad entre las sondas 657 y 736 utilizando el protocolo de Reyes 141 Tabla 23: Crecimiento comparativo de las cepas de referencia en los distintos medios de cultivo seleccionados 142 Tabla 24: Resultados de los tratamientos de descontaminación aplicados a una suspensión de N. asteroides 146 Tabla 25: Resultados de los tratamientos de descontaminación aplicados a una suspensión de G. amarae 146 Tabla 26: Resultados de los tratamientos de descontaminación aplicados a una suspensión de R. rhodochrous 146 Tabla 27: Resultados de los tratamientos de descontaminación aplicados a una muestra de fango inoculada con N. asteroides 147 Tabla 28: Resultados de los tratamientos de descontaminación aplicados a una muestra de fango inoculada con G. amarae 147 Tabla 29: Resultados de los tratamientos de descontaminación aplicados a una muestra de fango inoculada con R. rhodochrous 147 Tabla 30: Aislados obtenidos sin descontaminación 150 Tabla 31: Aislados obtenidos con descontaminación 151 Tabla 32: Identificación de cepas de Gordonia con el sistema MicroLog 156 Tabla 33: Identificación de Rhodococcus con el sistema MicroLog 157 X.-ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata 46 Figura 2: Detalle de la espuma de origen biológico producida por bacterias filamentosas 84 Figura 3: Esquema del protocolo de aislamiento de nocardioformes en muestras sin descontaminar 88 Figura 4: Esquema del protocolo de descontaminación con cloruro de benzalconio y con hidróxido sódico 89 Figura 5: Esquema del protocolo de descontaminación con N-Acetil-L- Cisteína 90 Figura 6: Equipo completo de MicroLog y microplaca GP2 108 Figura7: Cromatoplaca para la detección de ácidos micílicos 109 Figura 8: Cepas de referencia observadas al microscopio electrónico de barrido 111 Figura 9: Gel de extracción de DNA con los dos métodos ensayados 113 Figura 10: Gel con los productos de amplificación del 16S de Nocardia 114 Figura 11: Productos obtenidos por el análisis de restricción del gen 16S con Hpa II de Nocardia 115 Figura 12: Productos obtenidos por el análisis de restricción del gen 16S con Hae III de Nocardia 115 Figura 13: Productos de amplificación del gen HSP de Nocardia 117 Figura 14: Productos obtenidos por el análisis de restricción del gen HSP con Hpa II de Nocardia 117 Figura 15: Alineamiento de secuencias del iniciador G1 119 Figura 16: Alineamiento de secuencias del iniciador G2 120 Figura 17: Gel con los productos de amplificación del 16S de Gordonia 121 Figura 18: Gel con el producto de amplificación del 16S de R. equi 122 Figura 19: Gel con el producto de amplificación del 16S de R. erythropolis 122 Figura 20: Gel con los productos de amplificación del 16S de Rodococcus123 Figura 21: Hibridación in situ con la sonda EUB 338 según el protocolo de los Reyes 125 Figura 22: Hibridación in situ con la sonda 657 según el protocolo de los Reyes 127 Figura 23: Hibridación in situ con la sonda 736 según el protocolo de los Reyes 129 Figura 24: Hibridación in situ con la sonda EUB según el protocolo de Carr131 Figura 25: Hibridación in situ con la sonda 657 según el protocolo de Carr 133 Figura 26: Hibridación in situ con la sonda 736 según el protocolo de Carr 135 Figura 27: Medida de la intensidad de la señal utilizando el programa DP- Soft 137 Figura 28: Tinción Gram de una muestra de fango 149 Figura 29: Observación microscópica de un floculo con filamento GALO 149 Figura 30: Cromatoplaca con ácidos micólicos de mycolata 153 Figura 31: Gel de PCR de aislados de Nocardia 159 Figura 32: Productos obtenidos por el analisis de restricción del gen 16S con Hpa II de aislados de Nocardia 160 Figura 33: Productos obtenidos por el analisis de restricción del gen HSP con Hpa II de aislados de Nocardia 160 Figura 34: Gel con los productos de amplificación del 16S de Gordonia 162 Figura 35: Gel con los productos de amplificación del 16S de Rhodococcus 163 Figura 36: Bacteria nocardioforme teñida con DAPI y con EUB 338 165 Figura 37: Hibridación de una muestra de fango activo sin enriquecimiento y con enriquecimiento 167 Figura 38: Hibridación de muestras de fango con EUB y G. am-205 sin enriquecimiento 169 Figura 39: Hibridación de aislados de G. amarae con EUB y G. am-205 173