RESUMEN Los plaguicidas organofosforados son muy utilizados en agricultura debido a su escasa persistencia en el medio ambiente y gran actividad. Su aplicación puede provocar la aparición de residuos, cuya presencia en alimentos debe ser evaluada regularmente por su demostrada toxicidad. Entre los compuestos organofosforados más destacados, debido a su amplio uso, se encuentran: diazinón, fentión, malatión y clorpirifos. Estos insecticidas se utilizan como tratamientos fitosanitarios en el cultivo del olivar para controlar diferentes plagas. España es uno de los principales países productores y exportadores de aceite de oliva, por lo que mejorar su calidad y garantizar la seguridad alimentaria, es primordial para defender este producto. La mayoría de las determinaciones de residuos de plaguicidas se llevan a cabo en laboratorios centrales, utilizando métodos cromatográficos oficiales. Sin embargo, estas técnicas presentan ciertos inconvenientes, al requerir largos procedimientos de preparación de muestra con varias etapas de purificación -y a menudo derivatización de los analitos-, además de personal técnico especializado y equipos caros. Estos métodos tienen un uso restringido, ya que el número de muestras que pueden ser analizadas es limitado. El objetivo de esta Tesis es disponer de métodos que permitan el screening rápido y sensible de residuos de insecticidas organofosforados en aceite de oliva virgen extra, con la menor manipulación posible de la muestra y con bajo consumo de disolventes, de modo que sean aplicables en el propio campo y en las almazaras. Entre los métodos de screening sensibles, específicos, técnicamente sencillos, de bajo coste y que permiten procesar una gran cantidad de muestras en forma simultánea, se encuentran los basados en inmunoensayos. Se han desarrollado inmunoensayos en formato ELISA, para los plaguicidas diazinón, fentión, malatión y clorpirifos. Para ello, se han diseñado entre cinco y nueve haptenos para cada analito, con diferentes brazos espaciadores. Posteriormente, estos compuestos se conjugaron a proteínas, siendo utilizados para la inmunización de conejos. Los anticuerpos policlonales producidos se han caracterizado mediante ELISA, tanto en formato de conjugado inmovilizado (indirecto) como de anticuerpo inmovilizado (directo). Los inmunoensayos más sensibles se han obtenido en formato de conjugado inmovilizado y, tras la optimización de diferentes variables como pH, fuerza iónica, concentración de surfactante y tiempo de incubación, han mostrado valores de IC50 de 7,5 ng/mL para diazinón, 0,05 ng/mL para fentión, 1,6 ng/mL para malatión y 0,007 ng/mL para clorpirifos. Los ELISAs desarrollados son altamente específicos, excepto para clorpirifos, ya que reconocen a algunos compuestos estructuralmente similares. Tras estudiar la tolerancia de los ensayos a diferentes disolventes orgánicos, se ha desarrollado un método rápido y sencillo de extracción de residuos de plaguicidas en aceite de oliva virgen extra. Esta metodología, basada en extracción líquido-líquido y limpieza en frío, permite simplificar la etapa de tratamiento de muestra en comparación con las técnicas tradicionales para este tipo de matriz, lo que supone una reducción del tiempo de análisis y la posibilidad de llevarlo a cabo en las propias almazaras. Inicialmente, para la etapa de puesta a punto, esta técnica se ha aplicado a la determinación de residuos de atrazina en aceite de oliva. Se ha comprobado que este método de extracción también puede aplicarse a la determinación de residuos de los plaguicidas organofosforados objeto de estudio, sin más que realizar una dilución del extracto previa al análisis mediante ELISA. La metodología desarrollada -extracción y determinación- se ha aplicado a muestras de aceite de oliva virgen extra de diferentes procedencias. Los resultados obtenidos se han validado frente al método de referencia (GC-MS), alcanzándose buenas correlaciones. La misma metodología se ha aplicado también a otros aceites vegetales (orujo, maíz, girasol, soja) sin más que efectuar el calibrado en el mismo tipo de aceite que se desea analizar. Por último, se ha abordado el desarrollo de inmunoensayos rápidos basados en membranas para el análisis de residuos de diazinón, fentión, malatión y clorpirifos, utilizando la metodología ELIFA (enzimoinmunoanálisis en fase sólida por filtración en membrana). Combinando dicha metodología y el protocolo de extracción previamente desarrollado para aceite de oliva, se han obtenido valores de IC50 de 22, 4, 10 y 0,4 ng/mL para diazinón, fentión, malatión y clorpirifos, respectivamente, debido al proceso de inmunoconcentración que tiene lugar en la membrana. Además, la observación directa de la membrana permite discrimar muestras cuya concentración de residuos se sitúa por encima del LMR legislado para aceite de oliva, permitiendo el screening rápido e in situ de un gran número de muestras.