RESUMEN La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche supone un riesgo para la salud pública, ya que pueden ocasionar alergias, antibioresistencias y alteraciones intestinales, entre otros problemas. Además es una de las principales preocupaciones de la industria lechera, por su influencia negativa en los procesos de elaboración de determinados productos lácteos como el yogur y el queso. La información disponible sobre la termoestabilidad de los residuos de medicamentos en la leche, en concreto, en lo referente a las temperaturas de refrigeración y congelación empleadas a lo largo de las etapas de producción, transporte y análisis, así como de los tratamientos térmicos de calor utilizados en los laboratorios de control y en las industrias lácteas es, hasta el momento, muy limitada. Por ello se planteó la realización de este trabajo donde se ha evaluado por una parte la influencia de las condiciones de almacenamiento de la leche, en refrigeración y congelación, sobre algunos antimicrobianos pertenecientes a los antibióticos betalactámicos, tetraciclinas y sulfonamidas y por otra, se ha analizado el efecto del calentamiento de la leche a distintas temperaturas sobre la estabilidad de estas sustancias. El estudio de la influencia de la refrigeración (4 ± 2 ºC) y congelación (-20 ± 2 ºC) sobre los antimicrobianos en la leche se realizó mediante el análisis de muestras enriquecidas con 20 sustancias pertenecientes a los grupos de los antibióticos betalactámicos (penicilinas y cefalosporinas), tetraciclinas y sulfonamidas, a las concentraciones equivalentes a los Límites Máximos de Residuos (LMR), así como en sus correspondientes extractos obtenidos previo al análisis cromatográfico. Las determinaciones se realizaron mediante un equipo HPLC-MS/MS los días 0, 1, 2, 3, 7, 10, 15 y 30 de almacenamiento. La influencia del tiempo de conservación y el tipo de matriz (leche y extracto) sobre las pérdidas de concentración de los antimicrobianos se determinó mediante la aplicación del modelo cinético de primer orden a partir del cual se estimaron los porcentajes de degradación de cada sustancia estudiada. Los resultados obtenidos indican que la refrigeración y la congelación de la leche afectan a los antibióticos betalactámicos y tetraciclinas, tanto en los extractos como en las propias muestras, y no presentan ningún efecto sobre la estabilidad de las sulfonamidas. También señalan que la estabilidad de cada antimicrobiano depende de la temperatura empleada y del tiempo de almacenamiento, así como su interacción con el tipo de matriz (leche y extracto). Las pérdidas estimadas en la leche refrigerada durante 7 días oscilan entre el 14 y 90% siendo los antibióticos betalactámicos a excepción de la cefalexina las moléculas más inestables. En los extractos las pérdidas son, en casi todos los casos, menores. En la congelación los antimicrobianos mostraron por lo general mayor estabilidad en las muestras que en los extractos con porcentajes de degradación a los 7 días de congelación comprendidos entre 6,7 y 68,4% correspondiendo de nuevo las mayores degradaciones a los antibióticos betalactámicos, a excepción de la cefalexina y la cefquinoma. Por otra parte, los experimentos para analizar el efecto del calentamiento sobre la estabilidad de los antimicrobianos en la leche se llevaron a cabo mediante el estudio de cinco tratamientos consistentes en el calentamiento a 60, 70, 80, 90 y 100 ºC a diferentes tiempos sobre muestras adicionadas con un total de 22 sustancias antimicrobianas. En este estudio, los antimicrobianos pertenecientes al grupo de antibióticos betalactámicos y tetraciclinas se analizaron preparando soluciones fortificadas de leche a una concentración de 5000 ?g/kg y analizando las muestras tratadas a los diferentes tiempos de cada una de las temperaturas mediante un equipo HPLC-UV (penicilinas) y HPLC-PDA (cefalosporinas y tetraciclinas). En el caso de las sulfonamidas las muestras de leche se fortificaron a una concentración equivalente a 200 ?g/kg y se analizaron mediante HPLC-MS/MS. Los resultados de las pérdidas de concentración, a las diferentes temperaturas y tiempos de tratamiento, se interpretaron mediante la aplicación del modelo cinético de primer orden y la ecuación de Arrhenius, a partir de los cuales se estimaron los porcentajes de degradación de cada antimicrobiano para los tratamientos térmicos de calor, realizados frecuentemente, en los laboratorios de control así como en las industrias lácteas. De los resultados obtenidos en este estudio se concluye que la aplicación del modelo cinético de primer orden es adecuada para el estudio de la degradación térmica de los antimicrobianos en la leche. También, a partir del cálculo de la energía de activación y los tiempos de vida media, se deduce que las cefalosporinas son las moléculas más inestables, mientras que las tetraciclinas y sulfonamidas resultan mucho más termoresistentes. Respecto a la estimación de los porcentajes de degradación, según diferentes tratamientos, se observa que aquellos del laboratorio (40 ºC-10 min y 83 ºC-10 min) no producen apenas efectos, excepto el tratamiento de 83 ºC durante 10 minutos sobre algunas cefalosporinas. En cuanto a los tratamientos industriales (63 ºC-30 min, 72 ºC-15 s, 120 ºC-20 min y 140 ºC-4 s), la mayoría de ellos no parecen influir en la degradación de los antimicrobianos, excepto el tratamiento de 63 ºC durante 30 minutos en las cefalosporinas con porcentajes de degradación comprendidos entre el 14,0% (cefuroxime) y el 36,2% (cefapirina), y la esterilización de la leche en su envase (120 ºC-20 minutos) que provoca pérdidas importantes (37,4-100%) en todos los antibióticos betalactámicos, tetraciclinas y sulfonamidas, excepto para la sulfadimetoxina (6,5%) y sulfatiazol (9,9%). De todo ello, se puede resumir que las condiciones de almacenamiento, en refrigeración y congelación, de la leche pueden afectar a la estabilidad de los antibióticos betalactámicos y tetraciclinas por lo que se recomienda conservar las muestras de leche el mínimo tiempo posible antes de su análisis, tanto a 4 ºC como a -20 ºC, así como plantear la posibilidad de almacenar extractos en aquellas moléculas que presentan mayor estabilidad respecto a las muestras de leche. De esta forma se pretende reducir la posible variabilidad entre los resultados analíticos realizados en una misma muestra de leche a lo largo del tiempo y que puede ser la causa de resultados contradictorios entre los obtenidos en las diferentes etapas de control. En cuanto a los tratamientos térmicos de calor aquellos realizados en los laboratorios no producen apenas efectos de degradación sobre los antimicrobianos, al igual que los realizados en la industria láctea, salvo la esterilización de la leche en su envase, lo que significa que la mayor parte de tratamientos térmicos no actúan como barrera para impedir la llegada de sustancias antimicrobianas al consumidor, y por ello resulta necesario aplicar correctamente las medidas preventivas y de control a lo largo de toda la cadena de producción de la leche para evitar el riesgo potencial de la presencia de estas sustancias. Los resultados de este trabajo establecen un punto de partida hacia futuros estudios, así sería interesante analizar la estabilidad de otros grupos de antimicrobianos de uso emergente en la leche. También se considera de gran interés estudiar los cambios moleculares que se pueden producir en los antimicrobianos debido a los tratamientos térmicos y los posibles efectos toxicológicos y/o tecnológicos de sus metabolitos. Todo ello para colaborar con uno de los principios básicos de la seguridad alimentaria que es la protección del consumidor. Resumen Resumen