TÍTULO:
“Inmunomodulación de la infección de Plum pox virus mediante la expresión estable y transitoria de anticuerpos recombinantes contra la NIb replicasa viral en plantas de Nicotiana benthamiana”

RESUMEN
Plum pox virus (PPV) es miembro del género Potyvirus, causa la enfermedad de la sharka que tiene un serio impacto agrícola y económico sobre el cultivo de frutales de hueso. La utilización de variedades resistentes es la estrategia más duradera y definitiva en la lucha contra virosis de plantas. Por ello, se realiza un intenso esfuerzo en la búsqueda y obtención de cultivares resistentes o agronómicamente tolerantes frente a infección, ya sea por técnicas clásicas o métodos biotecnológicos.
En este contexto el objetivo general de esta tesis doctoral sería evaluar si la expresión de anticuerpos recombinantes específicos de proteínas de PPV en plantas Nicotiana benthamiana puede interferir o inmunomodular la infección viral y servir así como una estrategia para obtener resistencia.
En este trabajo se ha utilizado el fragmento de anticuerpo recombinante scFv2A que consiste en las regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo mAb 2A-IVIA clonadas de forma secuencial y unidas por un péptido de unión o “linker” de forma que sean expresadas como una sola cadena proteica o scFv (del inglés “single chain Fv variable fragment”). Los dos anticuerpos reconocen a la proteína NIb replicasa de PPV que tiene actividad RNA-polimerasa RNA-dependiente (RdRp). La NIb se localiza principalmente en el núcleo de células de plantas infectadas, aunque su función de replicación, presumiblemente, tiene lugar en estructuras membranosas derivadas del retículo endoplásmico (RE) en el citoplasma. 
Se transformaron plantas de Nicotiana benthamiana con tres versiones del fragmento recombinante scFv2A dirigidas a diferentes compartimentos celulares. Una versión citosólica (scFv2A), una versión nuclear (NLSscFv2A) y otra dirigida a membranas del RE (6K2scFv2A) por la cara citosólica. Se obtuvieron diversas líneas transgénicas: líneas A, líneas N y líneas K transformadas respectivamente con las construcciones scFv2A, NLSscFv2A y 6K2scFv2A. Para evaluar el nivel de resistencia de las diferentes líneas transgénicas, se realizaron ensayos indepedientes de desafío, mediante inoculación mecánica con extractos de plantas infectadas con virus o bien inoculando con un clon recombinante de PPV fusionado a GFP (PPV-GFP). Se pudo comprobar que las plantas de las diversas líneas transgénicas de N. benthamiana que expresaban los fragmentos scFv2A, 6K2scFv2A o NLSscFv2A presentaban diferentes grados de protección frente a la infección por PPV. En algunas de las plantas se observó una protección parcial, manifiesta por un retraso en la aparición de síntomas o por una menor acumulación viral. En otras se ha observado el bloqueo total de la infección, ya que no han presentado síntomas ni acumulación viral a lo largo del tiempo que duraron los ensayos de desafío. Además, se determinó que varias de las líneas transgénicas, tanto líneas A como K y N, presentaban porcentajes de infección significativamente menores comparados con los de los controles. El grado de protección dependió de la dosis de inóculo utilizada y del métod de inoculación utilizado. Por tanto, puede afirmar que la expresión en plantas de las diferentes versiones del fragmento scFv2A, de alguna forma, es capaz de interferir o inmunomodular el proceso de infección impidiendo su desarrollo normal. Sin embargo, como han apuntado otros autores, el nivel bajo de acumulación de los fragmentos scFv sería un factor que limitaría el efecto de protección ejercido.
Por otro lado, combinando la expresión transitoria scFvs mediante agroinfiltración y la agroinoculación del un clon viral PPV-GFP, se ha establecido un método alternativo, más rápido, para ensayar la efectividad los fragmentos scFv frente a la infección viral. Este método ha sido aplicado para evaluar de forma cuantitativa la efectividad de los diferentes fragmentos scFv2A, de forma que sirva de punto de comparación para valorar la eficacia de versiones mejoradas y más estables del fragmento scFv2A o incluso scFv con diferentes especificidades.  De esta forma, en un futuro, se podrían seleccionar para la transformación estable los candidato con el mayor grado de efectividad posible y asegurar así el resultado de la estrategia de inmunomodulación en la obtenición de resistencia a PPV.