TÍTOL:
“Immunomodulació de la infecció de Plum pox virus mitjançant l'expressió estable i transitòria d'anticossos recombinants contra la NIb replicasa viral en plantas de  Nicotiana benthamiana”

RESUM:
Plum pox virus (PPV) és membre del gènere Potyvirus, causa la malaltia de la sharka que té un seriós impacte agrícola i econòmic sobre el cultiu de fruiters d'os. La utilització de varietats resistents és l'estratègia més duradora i definitiva en la lluita contra virosi de plantes. Per això es realitza un intens esforç en la busca i obtenció de cultivars resistents o agronòmicament tolerants front a la infecció, ja siga mitjançant tècniques clàssiques o mètodes biotecnològics.
En aquest context l'objectiu general d'aquesta tesi doctoral seria avaluar si l'expressió d'anticossos recombinants específics de proteïnes de  PPV en plantes Nicotiana benthamiana pot interferir o immunomodular la infecció viral i servir així com estratègia per a obtenir resistència.
En aquest treball s'ha utilitzat el fragment d'anticòs recombinen-te scFv2A que consistix en les regions variables de la cadena lleugera i pesada de l'anticòs mAb 2A-IVIA clonades de forma seqüencial i unides per un péptid d'unió o “linker” de manera que siguen expressades com una sola cadena proteica o scFv (de l'anglés “single chain variable fragment”). Els dos anticossos reconeixen a la proteïna NIb replicasa de PPV que té activitat RNA-polimerasa RNA-dependent (RdRp). La NIb es localitza principalment en el nucli de cèl·lules de plantes infectades, encara que la seua funció de replicación, presumiblement, té lloc en estructures membranoses derivades del reticle endoplàsmic (RE) en el citoplasma. 
Es van transformar plantes de Nicotiana benthamiana amb tres versions del fragment recombinen-te scFv2A dirigides a diferents compartiments cel·lulars. Una versió citosólica (scFv2A), una versió nuclear (NLSscFv2A) i una altra dirigida a membranes del RE (6K2scFv2A) per la cara citosòlica. Es van obtenir diverses línies transgèniques: línies A, línies N i línies K transformades respectivament amb les construccions scFv2A, NLSscFv2A i 6K2scFv2A. Amb algunes d'aquestes línies transgèniques es van realitzar assajos independents de resistència a PPV per mitjà d'inoculació mecànica amb extractes de plantes infectades amb virus o bé inoculant amb un clon recombinant de PPV fusionat a GFP (PPV-GFP). 
S'ha pogut comprovar que les plantes de les diverses línies transgèniques de N. benthamiana que expressen els fragments scFv2A, 6K2scFv2A o NLSscFv2A presenten diferents graus de protecció enfront de la infecció per PPV. En algunes de les plantes s'ha observat una protecció parcial, manifesta per un retard en l'aparició de símptomes o per una menor acumulació viral. En altres s'ha observat el bloqueig total de la infecció, ja que no han presentat símptomes ni acumulació viral al llarg del temps que van durar els assajos de desafiament. Encara que cap de les línies transgènica assajades ha mostrat  protecció en totes les seues plantes a la infecció per PPV, almenys amb els mètodes d'inoculació i dosi utilitzats, es pot afirmar que  l'expressió en plantes de les diferents versions del fragment scFv2A, d'alguna forma, és capaç d'interferir o inmunomodular el procés d'infecció impedint el seu desenvolupament normal. Encara que, com han apuntat altres autors, el baix nivell d'acumulació dels fragments scFv seria un factor que limitaria l'efecte de protecció exercit. 
	A més a més, combinant l'expressió transitòria scFvs per mitjà d'agroinfiltración i l'agroinoculación d'un clon viral PPV-GFP, s'ha establit un mètode alternatiu, més ràpid, per a assajar l'efectivitat els fragments scFv enfront de la infecció viral. Aquest mètode ha estat aplicat per avaluar de forma quantitativa l'efectivitat dels diferents fragments scFv2A per a interferir amb la infecció viral, de manera que serveixi de punt de comparació per a valorar l'eficàcia de versions millorades i més estables del fragment scFv2A o scFv amb diferents especificitats. D'aquesta forma es podrían seleccionar per a la transformación estable candidats amb el major grau d'efectivitat possible per assegurar d'aquesta manera el resultat de la estratègia de la immunomodulació en la obtenció de resistencia a PPV.