ANÀLISI DE LES RELACIONS ESTRUCTURA-FUNCIÓ EN EL VIRUS DE L'ARABESC DEL PELARGONIUM Una prospecció realitzada recentment a Espanya ha posat de manifest que el virus de l'arabesc del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV) és l'agent de tipus viral més freqüent en gerani (Pelargonium spp.) amb percentatges d'incidència que oscil·len entre el 40 i el 90% depenent de l'àrea geogràfica examinada. Una situació similar és previsible en països del nostre entorn i, probablement, en altres més allunyats. Es tracta d'un virus amb partícules isomètriques i un genoma monopartit de RNA de simple cadena i polaritat positiva les infeccions naturals del qual semblen restringides a espècies del gènere Pelargonium, encara que experimentalment pot infectar espècies molt diverses. Donada l'escassesa de dades sobre el PLPV i la importància que el virus està adquirint com a patogen, en aquesta tesi hem pretès aprofundir en les seues característiques biològiques i moleculars. El primer objectiu abordat en aquest treball ha estat determinar la seqüència nucleotídica completa del seu RNA genòmic (gRNA). Aquesta molècula està constituïda per 3883 nt i, mitjançant anàlisi in silico, inicialment identificàrem sis marcs oberts de lectura (ORFs) que potencialment codificaven proteïnes de 27 (p27), 13 (p13), 87 (p87), 7 (p7), 6 (p6), i 37 kDa (p37). Aquestes ORFs estan flanquejades per una regió no traduïble (UTR) en 5´ inusualment curta, amb només 6 nt, i per una 3´ UTR de 246 nt. Tant l'organització de les ORFs en l’ RNA viral com la majoria dels seus productes potencials s'assemblaven molt als implicats en replicació (p27 i p87), moviment (p7) i encapsidació (p37) de membres del gènere Carmovirus (família Tombusviridae). A pesar de les semblances que compartia el PLPV amb membres d'aquest gènere, els carmovirus produïxen dos RNAs subgenòmics (sgRNAs) per a la síntesi de les proteïnes de moviment i de coberta, mentre que un anàlisi Northern va indicar que el PLPV genera un sol sgRNA d'aproximadament 1.7 kb presumiblement implicat en la traducció de les proteïnes p7, p6 i p37. A més, la regió central del genoma dels carmovirus conté dos xicotetes ORFs normalmente en diferents fases de lectura i amb codons d'iniciació canònics que codifiquen dues proteïnes de moviment. No obstant això, solament la p7 potencialment codificada pel PLPV mostrava homologia significativa amb proteïnes de moviment mentre que no es van trobar homòlegs clars per a la p6 (cal ressenyar que tampoc per a la p13). A més aquesta p6 del PLPV havia d’ésser expressada a partir d'una ORF amb un codó d'iniciació no canònic i/o, alternativament, mitjançant un mecanisme de “-1 frameshift” (FS) o de corriment de pauta de lectura que es produiria immediatament aigües dalt del codó de parada de la ORF (p7), generant-se una proteïna de 12 kDa (p7-FS o p12). Aquesta possibilitat es veia recolzada per la presència, immediatament aigües a dalt de l'esmentat codó, d'un heptanucleòtid la seqüència del qual s'ajusta al motiu característic d'aquest tipus de mecanisme, i per la possible formació d'una estructura de tipus forqueta aigües abaix de l'esmentat codó. És remarcable que tant l'organització de ORFs com les estratègies d'expressió gènica predites per al sgRNA del PLPV eren molt similars a les descrites per a l'únic sgRNA del virus del mosaic del Panicum (PMV), que constituïx el gènere Panicovirus dins de la família Tombusviridae. A més del PLPV, s'havien descrit un conjunt de xicotets virus isomètrics les infeccions naturals dels quals semblaven també restringides a espècies del gènere Pelargonium, entre els quals es trobaven el virus de les taques anulars de Pelargonium (Pelargonium ringspot virus, PelRSV) i el virus de l'anell cloròtic del Pelargonium (Pelargonium chlorotic ring pattern virus, PCRPV). Curiosament el PCRPV codifica potencialment cinc proteïnes molt similars a les implicades en replicació (p27 i p87), moviment (p7 i p9) i encapsidació (p37) del gènere Carmovirus, però produix un únic sgRNA presumiblement implicat en la traducció de les ORFs allunyades de l'extrem 5´ del gRNA i podria utilitzar un mecanisme -1 FS per a la traducció d'una ORF interna de poca grandària, igual que havia estat predit per al PLPV. Algunes dades indiquen que aquestes característiques podrien ser compartides pel PelRSV i pel virus latent de la baia del saüc (Elderberry latent virus, ELV) i, sobre la base d'aquestes característiques comunes i de similituds de seqüència, es va proposar incloure als quatre agents virals en un nou gènere dins de la família Tombusviridae, amb el nom provisional de Pelarspovirus. Les peculiaritats genòmiques del PLPV (i la seua possible adscripció a un nou gènere) mereixien sens dubte ser estudiades en major profunditat, per això el següent objectiu va ser la generació d'un clon infecciós del virus per a portar a terme un anàlisi detallat de les relacions estructura-funció en el patogen. Amb esta finalitat, fusionarem un cDNA viral de longitud completa al promotor de l’ RNA polimerasa del fago T7 i ho lligarem a un vector de clonació d'alt nombre de còpies. Els transcrits generats in vitro a partir de la construcció resultant es van inocular mecànicament en diferents hostes experimentals. Els resultats van mostrar que els RNAs del PLPV sintetitzats in vitro donaven lloc a infeccions indistingibles d'aquelles establertes per l'aïllat viral de partida en plantes de C. quinoa, N. clevelandii i N. benthamiana. Disposar d'aquesta eina ens va permetre desenvolupar estratègies per a obtenir informació sobre el paper de les distintes ORFs en el cicle biològic del virus i dels mecanismes que intervienen en la seua expressió. Mitjançant experiments de traducció in vitro i bioassajos de distints mutantes identificàrem les ORFs biològicament actives del PLPV i vam obtenir dades sobre la/les etapa(es) del cicle infecciós en la/les que estan involucrades. Les funcions predites inicialment per a les ORFs (p27), (p87), presumptivament implicades en replicació, i per les ORFs (p7) i (p37), en moviment i encapsidació, respectivament, eren consistents amb els resultats d'aquest treball, mentre que les ORFs (p13) i (p6), inicialment identificades in silico, no eren traduïdes in vitro ni requerides in vivo, de manera que probablement careixen de significat biològic. En el seu lloc es va identificar una nova ORF, localitzada en la regió central del genoma, que es traduïa a partir d'un codó feble d'iniciació (GUG) i que donava lloc a una proteïna de grandària 9.7 kDa implicada en el moviment del virus. Aquesta proteïna a més, mostrava una notable identitat de seqüència (44,4%) amb una altra de grandària 9.4 kDa, potencialment codificada per una ORF del PCRPV també situada en la regió central del genoma i que el seu codó d'inici era, així mateix, un triplet no-AUG, el que ampliava les semblances entre aquests dos virus, ambdós membres provisionals del gènere proposat Pelarspovirus. Una vegada determinada la funció de les proteïnes codificades pel PLPV es va iniciar un estudi sobre les estratègies que utilitza aquest patogen per a l’expressió de tots els seus gens. Assajos de traducció in vitro van confirmar que: I) el gRNA dirigeix la síntesi de les proteïnes p27 i p87 de manera eficient (l'última mitjançant un mecanisme de lectura a través del codó de parada feble del gen p27), malgrat mancar d'una estructura cap en el seu extrem 5’, com ocorre en la resta de membres de la família Tombusviridae, i presentar una seqüència capdavantera extremadament curta (6 nt) i, II) el sgRNA actua com mRNA per a la producció de les tres proteïnes restants, p7, p9.7 i p37, mitjançant escapes al procés de rastrege ribosomal o leaky-scanning. Aquests processos semblen estar afavorits pel context subòptim del codó d'inici del gen p7, pel codó feble d'inici (GUG) del gen p9.7, i per l'absència de codons AUG adicionals en qualsevol pauta de lectura en la regió que precedeix al codó d'inici del gen p37 en el sgRNA. Finalment es va portar a terme un anàlisi de la variabilitat genètica del PLPV per tal d’obtindre informació sobre les pressions selectives que operen sobre el genoma del virus. Per a tal efecte, es va partir d'una col·lecció d'aïllats provinents de plantes de P. zonale o P. peltatum amb diferents orígens geogràfics i/o amb diferents dates de recol·lecció. La regió genòmica examinada, de 1817 nt, comprenia una regió parcial del gen de la RdRp, els gens de les proteïnes de moviment (p7 i p9.7) i de la CP, i la 3’ UTR. L'anàlisi de les seqüències obtingudes ha permès determinar alguns dels factors que actuen limitant l'heterogeneïtat viral com són la conservació de les seqüències aminoacídiques de determinats dominis de les proteïnes, i la preservació del plegament de regions reguladores del genoma viral. L'estudi de covariacions dins i entre proteïnes també ha permès identificar una suposada xarxa d'interaccions específiques probablement requerida per a mantenir la conformació correcta de les proteïnes virals i per a conduir l’RNA viral des del procés de replicació fins a la seua disseminació en la planta. Addicionalment, mitjançant passades seriades d'un aïllat del PLPV en l'hoste experimental C. quinoa, s'ha demostrat que aquest patogen és capaç d'evolucionar de forma molt ràpida i reproduïble quan és transferit a una nova espècie vegetal. Aquesta observació posa de manifest el paper crític que ocupen les pressions selectives exercides per l'hoste en l'estructura genètica de les poblacions del virus i suggereix que la taxa de mutació del PLPV és inusualment elevada.