DETECCIÓ I CARACTERITZACIÓ AGRONÒMICA DE VIROIDES DE CÍTRICS. IDENTIFICACIÓ I CARACTERITZACIÓ MOLECULAR Y BIOLÒGICA DE VARIANTS DEL VIROIDE DEL NANISME DELS CÍTRICS (CDVd).

RESUM
      Els cítrics son hostes naturals de varies espècies de viroides, totes pertanyent a la família Pospiviroidae. Estudis preliminars per a detectar viroides en espècies i varietats comercials donaren uns resultats molt erràtics, a no ser que s’utilitzés l’espècie indicadora cidre Etrog com a hoste bioamplificador. Per tal d’evitar la utilització d’aquest hoste en els assaigs de detecció rutinària de viroides es desenvolupà un mètode basat en la hibridació “northern”. El protocol consistí en: (i) Extracció d’àcids nuclèics de mostres d’escorça preses en diferents èpoques de l’any i/o emmagatzemades en diferents condicions; (ii) separació dels RNAs en 5% PAGE o en 1% agarosa i transferència a membranes; (iii) hibridació amb sondes de DNA específiques per cada viroide i marcades amb digoxigenina (DIG), detecció amb un anticòs anti-DIG conjugat amb fosfatasa alcalina y revelat amb un substrat quimioluminiscent (CSPD). Amb aquest mètode s’han pogut detectar els viroides en totes les espècies de cítrics assajades. La tècnica es molt sensible, i permet reduir el temps necessari per a una detecció fiable de tots els viroides de cítrics descrits fins ara. 
      Aplicant eixa tècnica s’han pogut realitzar prospeccions de viroides en arbres cultivats en varies regions citrícoles de Colombia, Perú i Brasil. En llimes Tahití de Colombia s’hi han identificat infeccions múltiples de HSVd i CDVd o de CEVd, HSVd i CDVd. Les mostres del Banc de Germoplasma de Palmira estaven exemptes de viroides, excepte una font de cidre Etrog que estava infectada amb CEVd i CDVd. La caracterització molecular dels aïllaments de HSVd, CDVd i CEVd recuperats de les mostres analitzades ha mostrat que: (i) tots els aïllaments de HSVd no tenien el motiu d’expressió de la caquexia, i per tant es tracta de variants no patogèniques, excepte un que si que tenia eixe domini; (ii) els aïllaments de CDVd tenien variants amb una elevada identitat nucleotídica respecte a la variant de referència CVd-IIIb; (iii) un dels aïllaments de CEVd (CEVdCO) procedent d’un cidre Etrog asintomàtic presentava una identitat nucleotídica del 96,5% amb la seqüència de referència de la classe A (que engloba les variants agressives d’eixe viroide) i del 98,9% amb la seqüència de referència V1 que causa símptomes molt agressius en cidre Etrog. Els canvis nucleotídics entre CEVdCO i la variant V1 son: U186A (domini TR), A235U (domini V) i AU313-314GA (domini P). Donada la comprovada implicació del domini P en la patogènesi del CEVd, s’han obtingut mutants artificials en las posicions 313-314 del V1 i del CEVdCO per tal de poder demostrar si els canvis identificats en el CEVdCO eren efectivament els responsables de que els cidres infectats amb aquesta font de CEVd no mostressin símptomes.

      L’anàlisi d’una sèrie de clons de llima Tahití procedents del Perú i del Brasil i que manifestaven el síndrome del “quebra-galho” (expressió que en portuguès significa “rama trencadissa”), i que està caracteritzat per la formació d’esquerdes a l’escorça, nanisme i copa molt oberta, però que per altre banda tenen característiques productives interessants, ha mostrat que estaven infectats amb CEVd, HSVd i CDVd (clons del Perú) o amb CEVd i CDVd (clons del Brasil). Els resultats d’un estudi realitzat en condiciones de camp per tal de determinar si eixos viroides eren els responsables del síndrome del “quebra-galho” han mostrat que el CEVd causa esquerdes a l’escorça dels arbres de llima Tahití desprès de dos anys d’haver estat inoculats, però es necessari un major desenvolupament dels arbres, per poder confirmar que eixe viroide es efectivament responsable tots els símptomes característics del síndrome del “quebra-galho”.
      El viroide del nanisme dels cítrics (CDVd) està molt dispers en les regions citrícoles del mon però els seus efectes passen inadvertits ja que no indueix símptomes específics malgrat haver-se provat que causa una reducció de la mida dels arbres infectats. Partint de 33 aïllaments s’ha realitzat un estudi per tal d’identificar i caracteritzar variants d’eixe viroide. L’anàlisi per SSCP ha mostrat que cada aïllat estava compost per poblacions de variants de seqüència, i amb la informació obtinguda s’ha identificat y seqüenciat la variant mes freqüent, que es per tant la mes representativa de cada cas. Amb els resultats de l’anàlisi filogenètic s’ha determinat la seua relació amb les variants de referència (CVd-IIIa, CVd-IIIb i CVd-IIIc). S’han seleccionat cinc seqüencies representatives de cada un dels cinc grups majoritaris de l’arbre filogenétic per tal de caracteritzar-los biològicament en l’espècie indicadora cidre Etrog. Amb l’anàlisi de les dades de creixement i d’expressió de símptomes s’ha vist que dues variants es comportaven com a races agressives, dues com a moderades y una com a molt suau. Els canvis típics d’eixes variants s’han relacionat amb la modulació dels símptomes.
      Per tal d’analitzar l’efecte dels viroides en el comportament del cultiu en el camp, es realitzà un seguiment i presa de dades dels arbres d’una parcel·la de taronger Washington navel empeltat en citrange Carrizo i inoculats amb dotze fonts de viroides. L’anàlisi estadístic dels paràmetres estudiats (alçada del arbre, grossor del tronc, mida de la copa, i quantitat i qualitat de la collita) presos durant quatre campanyes successives han mostrat que hi han molt poques diferencies estadístiques entre els tractaments.