RESUMEN
      
      El estudio de los mecanismos de reprogramación nuclear tiene actualmente una notable importancia, dado que el dominio de estos procesos constituyen la clave para actuar eficazmente en cuestiones tan dispares como el cáncer o la medicina regenerativa. También resulta muy importante este tipo de estudios sobre reprogramación cuando se pretende la obtención de animales transgénicos múltiples y orientados.
      Aunque para ello se pueden utilizar muy diversos modelos animales, en nuestro caso, se ha optado por el pez cebra, dado el bajo coste económico que requiere, así como algunas de las características (brevedad en el desarrollo embrionario, transparencia de los embriones…) y el conocimiento de su genoma, entre otras. Bien es cierto que a estas ventajas le acompañan cierto inconvenientes tales como no disponer hasta este momento de técnicas tales como el transplante nuclear y, a otro nivel, el quimerismo. Técnicas cuyos desarrollo se pretende en esta tesis, lo que justifica los objetivos aquí planteados.
      Para ello se han realizado diferentes trabajos experimentales titulados: “Ultraviolet radiation and handling medium osmolarity affect chimaerism success in zebrafish”, “Evaluation of presumptive caudal fin blastema cells as candidate donors in intraspecies zebrafish (Danio rerio) chimaeras”, “Definition of three somatic adult cell nuclear transplant methods in zebrafish (Danio rerio): before, during and after egg activation by sperm fertilization”, “Transplant of adult fibroblast into the central region of metaphase II eggs resulted in mid blastula transition (MBT) embryos”, “Electroactivation of zebrafish (Danio rerio) eggs”, “Comparison of different activating stimuli efficiency in zebrafish nuclear transplant”, “Reconstruction of heteroparental gynogenetic diploid condition by nuclear transplant in zebrafish”.
      Los dos primeros relativos al quimerismo, su eficiencia final se optimizó mediante la penalización con radiación UV del embrión receptor y, además, realizando la manipulación en un medio con osmolaridad idéntica a la del medio interno del pez cebra. Con ello se lograron tasas de quimerismo en la línea germinal de hasta un 50%
      La técnica de quimerismo se utilizó ya en esta tesis para comprobar hasta qué punto las células de la blastema, consecuencia de la amputación experimental de la aleta caudal, alcanzan la pluripotencialidad en su proceso de reprogramación, lo que no parece ocurrir.
      En los cuatro trabajos dedicados al desarrollo de la técnica de transplante nuclear se ha podido comprobar que el transplante puede hacerse sobre oocitos ya activados, simultáneo a la activación e incluso previo a la activación, superando así la dificultad que supone la localización del micropilo. Además se ha comprobado que la eficacia del desarrollo partenogenota depende extraordinariamente del estímulo de activación usado, siendo máximo con espermatozoide y muy reducido con agua. A este respecto, señalar que también se ensayó un tratamiento de refuerzo del estímulo de activación basado en la aplicación de pulsos eléctricos en medio iónico que, desafortunadamente, supuso la lisis oocitaria cuando se aplicó sobre oocitos manipulados, pero no en oocitos intactos.
      Durante el desarrollo de este trabajo de tesis surgió, en el grupo de investigación, una variante del transplante nuclear que se consideró de especial interés y que supone retomar una línea de investigación desarrollada tiempo atrás en mamíferos: la hemiclonación. En el caso actual, utilizando el pez cebra, supone la obtención de larvas ginogenotas haploides que, a las 24h, son utilizadas para generar cultivos primarios de células somáticas haploides larvarias. Seguidamente, dichas células se utilizaron para reconstituir la condición diploide de oocitos no enucleados mediante su transplante nuclear. Cabe decir que las combinaciones de apareamientos de núcleos somáticos y de residentes que esta técnica permite son muchos más que la aquí ensayada. Esta última técnica permitirá la realización de estudios sobre reprogramación e imprinting gamético que no son abordables en mamíferos.