Resumen El virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV) es uno de los principales virus que afectan al cultivo del tomate y está ampliamente extendido por las diferentes zonas productoras del mundo, donde provoca importantes pérdidas económicas. Su eficiente transmisión mecánica hace que se trate de un virus de rápida dispersión y difícil control. La gran variabilidad sintomatológica unida a una gran diversidad molecular, dificulta su diagnóstico. Por el momento existen cinco genotipos caracterizados, aunque aún no se conoce que región del genoma del virus se encarga de la expresión de los síntomas. La construcción de clones infecciosos y su marcaje con proteínas fluorescentes es una herramienta eficaz para profundizar en el conocimiento de la biología molecular de los virus vegetales. Del mismo modo, la interacción del PepMV con otros agentes como el hongo Olpidium brassicae sensu lato (sl) se ha relacionado con el síndrome del “colapso”, pero aún se desconoce si dicha relación lleva asociada la transmisión del virus por este hongo vector. Por tanto, se desarrolló un método de diagnóstico que permitía la identificación y detección simultánea de los cinco genotipos del PepMV descritos por el momento: Europeo (EU), Peruano (PE), Chileno 1/US1 (CH1/US1), Chileno 2 (CH2) y US2. El método diseñado consistía, en primer lugar en la realización de una multiplex RT-PCR en un paso, con una mezcla de seis de cebadores específicos que amplifican una zona del gen de la RNA polimerasa RNA dependiente del virus, incluyendo un control interno, separándose así tres grupos de genotipos diferentes: EU/PE, CH1/US1 y CH2/US2. Para diferenciar el genotipo presente en la muestra entre los cinco determinados, se llevó a cabo un análisis de restricción con el enzima SacI con el producto de PCR obtenido. El método presentó un límite de detección y sensibilidad mayor que otras técnicas de diagnóstico comúnmente empleadas. Por otro lado, se construyó un clon infeccioso de PepMV a partir del genoma completo de un aislado del genotipo CH2 de PepMV, consiguiendo transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el aislado original tras la inoculación mecánica a Nicotiana occidentalis H-H Wheeler. Posteriormente, se obtuvo un clon mutante de ese mismo aislado con el gen de la proteína fluorescente verde GFP, incluido en la región intergénica existente entre la ORF 4 y 5 del PepMV. Para verificar la capacidad de O. brassicae sl (concretamente la especie Olpidium virulentus (Sahtiyanci) Karting) para transmitir el PepMV, se realizaron dos experimentos en cámara de cultivo donde se consiguió la transmisión del virus a planta de tomate sana mediante el riego de ésta última con el percolado obtenido tras el riego de plantas infectadas con PepMV que contenían un cultivo de O. virulentus en sus raíces, procedente de tomate. En otro orden de cosas, en 2007 se identificó como agente causal de la enfermedad conocida como “torrao”, al nuevo virus Tomato torrado virus (ToTV). Este hecho determinó la necesidad de conocer diversos aspectos de su epidemiología, diagnóstico, variabilidad y posible efecto sinérgico de éste con otras virosis que afectan habitualmente al cultivo del tomate en España. Para ello, en primer lugar se estudiaron la incidencia y distribución de la enfermedad del “torrao”, realizando muestreos en las principales zonas productoras de España desde 2001 a 2008. Se recogieron 451 muestras en 92 invernaderos, se clasificaron por su sintomatología y se analizaron frente a diversos virus. Más del 75% de las muestras analizadas resultaron positivas a ToTV, de las cuales la mayoría mostraban los síntomas típicos de la enfermedad, sin embargo, algunas mostraban otras manifestaciones de necrosis y otras incluso resultaron asintomáticas. El 60,5% de las plantas analizadas presentaron co-infección de ToTV y PepMV, y una pequeña proporción resultaron infectadas con otras virosis del tomate. Asimismo, se demostró que la detección de ToTV mediante hibridación molecular con improntas de de tejido sobre la membrana es una técnica eficaz para el diagnóstico rápido de este nuevo virus. Adicionalmente, se muestrearon y analizaron frente a ToTV diferentes especies de la flora arvense encontradas en invernaderos de tomate de Murcia, Gran Canaria y Tenerife, de las cuales 22 pertenecientes a diversos géneros botánicos resultaron positivas al virus. Una vez analizadas las muestras de campo, se eligieron aquellas que presentaron infecciones simples con ToTV, así como otras muestras que estaban infectadas con este virus y otros encontrados habitualmente afectando al cultivo de tomate. Estas muestras se observaron mediante microscopía electrónica de transmisión para estudiar los efectos citopatológicos inducidos por el ToTV y evaluar el posible efecto sinérgico de la co-infección de éste con otras entidades virales a nivel ultraestructural. Las hojas infectadas únicamente con ToTV no presentaron grandes alteraciones celulares, a pesar de que se observaron cuerpos de inclusión conteniendo partículas virales isométricas en las células parenquimáticas del floema. Los tejidos con infecciones dobles de ToTV y PepMV, o ToTV y Tomato chlorosis virus (ToCV) manifestaron mayores alteraciones. Sin embargo, el efecto más perjudicial para los tejidos fue el causado por la infección triple de ToCV, PepMV y Tomato spotted wilt virus (TSWV) donde se observó un claro engrosamiento de la pared celular acompañado de una gran cantidad de células necrosadas. Finalmente, se estudió la variabilidad genética de 19 aislados españoles de ToTV recogidos en diversas áreas productoras de tomate del país a lo largo de 9 años. En el estudio también se incluyeron tres aislados húngaros del virus. Se estudiaron cinco regiones del genoma del virus: proteasa-cofactor, la RNA polimerasa RNA dependiente, la proteína de movimiento y dos subunidades de la proteína de la cápside (Vp35 y Vp23). Todos los aislados presentaron una gran similitud en todas las zonas estudiadas. Los análisis filogenéticos revelaron un único grupo que englobaba a todos los aislados del ToTV estudiados separándolos de otros virus del nuevo género propuesto Torradovirus. Sin embargo, se observó un subgrupo en las dos subunidades de la CP estudiadas constituido por los aislados de tomate recogidos en Gran Canaria y un aislado procedente de S. nigrum recogido en Tenerife. Las regiones estudiadas estaban bajo una fuerte presión de selección negativa, encontrándose nueve nucleótidos bajo presión de selección negativa repartidos entre diversas zonas del genoma, frente a uno en la zona de la proteasa-cofactor bajo presión de selección positiva. Resumen_______________________________________________________________ iv iii Resumen