Resum El virus del mosaic del cogombre dolç (PepMV) és un dels principals virus que afecten al cultiu de la tomaca i es troba àmpliament estés per les diferents zones productores del món, provocant importants pèrdues econòmiques. La seua eficient transmissió mecànica fa que es tracte d’un virus de ràpida dispersió i difícil control. La gran variabilitat simptomatològica unida amd la seua gran diversitat molecular, dificulta el seu diagnòstic. Fins ara han sigut caracteritzats cinc genotipus distints, encara que no es conega la regió del genoma del virus encarregada de l’expressió dels símptomes. La construcció de clons infecciosos i el seu marcatge amb proteïnes fluorescents és una eina eficaç per aprofundir en el coneixement de la biología molecular dels virus vegetals. De la mateixa manera, l’interacció del PepMV amb altres agents com el fonc Olpidium brassicae sensu lato s’ha relacionat amb el síndrome del “col·lapse”, encara que es desconeix si es produeix la transmissió del virus per aquest fonc vector. Per tant, es va desenvolupar un mètode de diagnòstic que va permetre l’identificació i detecció simultània dels cinc genotipus del PepMV descrits: Europeu (EU), Peruà (PE), Xilè 1/US1 (CH1/US1), Xilè 2 (CH2) i US2. El mètode dissenyat va consistir, en primer lloc, en la realització d’una multiplex RT-PCR en un pas, amb una barreja de sis cebadors específics que amplifiquen una zona del gen de la RNA polimerasa RNA dependent del virus, incloent un control intern, separant així tres grups de genotipus diferents: EU/PE, CH1/US1 i CH2/US2. Per a poder diferenciar quin dels cinc aïllats està present en la mostra, es va efectuar un anàlisi de restricció amb l’enzim SacI del producte obtés. El mètode va presentar un límit de detecció i sensibilitat major que altres tècniques de diagnòstic comúnment empleades. D’altra banda, es va sintetitzar un clon infecciós de PepMV a partir del genoma complet d’un aïllat del genotipus CH2 de PepMV, aconseguint transcrits in vitro capaços de reproduir la mateixa simptomatología del aïllat original després de l’inoculació mecànica a Nicotiana occidentalis H-H Wheeler. Posteriorment, es va obtindre un clon mutant d’eixe mateix aïllat amb el gen de la proteïna fluorescent verd (GFP), inclós en la regió intergènica existent entre la ORF 4 i 5 del PepMV. Per a verificar la capacitat de O. Brassicae sl (concretament la espècie Olpidium virulentus (Sahtiyanci) Karting) de transmetre el PepMV, es van realitzar dos experiments en càmera de cultiu on es va lograr la transmissió de PepMV a planta de tomaca sana mitjançant el seu rec amb el residu filtrat obtingut del rec de plantes infectades amb PepMV que contenien un cultiu de O. virulentus en les seues arrels, procedent de tomaca. Així doncs en 2007 es va identificar com agent causal de la malaltia coneguda com “torrao” al nou virus Tomato torrado virus (ToTV). Aquest fet va determinar la necessitat de conèixer diverses aspectes de la seua epidemiología, diagnòstic, variabilitat i possible efecte sinèrgic d’aquest amb altres virus que afecten habitualment al cultiu del tomaca en Espanya. Es van estudiar l’incidència i distribució de la malaltia del”torrao”, prenent mostres de les principals zones productores d’Espanya des de 2001 a 2008. Es van agafar 451 mostres en 92 hivernacles, classificant-se segons la seua símptomatología i analitzant-se front a diversos virus. Més del 75% de les mostres analitzades van resultar positives a ToTV, de les quals, la majoria mostraven els símptomes típics de la malaltia. No obstant, altres plantes van mostrar altres manifestacions de necrosi, i altres resultaren asimptomàtiques. El 60,5% de les plantes analitzades van presentar co-infecció de ToTV i PepMV, i una petita proporció van ser infectades amb altres virus de la tomaca. Tanmateix, es va demostrar que la detecció de ToTV mitjançant hibridació molecular amb empremtes de teixit sobre la membrana és una tècnica eficient per al diagnòstic ràpid d’aquest nou virus. Adicionalment, es van prendre mostres i es van analitzar front a ToTV diferents espècies de la flora arvense trobades en hivernacles de Múrcia, Gran Canària i Tenerife, de les quals 22 pertanyents a diversos gèneres botànics van resultar positives. Una vegada analitzades les mostres, es van triar les que presentaven infeccions simples amb ToTV, o infeccions mixtes d’aquést amb altres virus trobats habitualment al cultiu de la tomaca. Aquestes mostres es van observar mitjançant microscopia electrònica de transmissió per a estudiar els efectes citopatològics induïts pel ToTV i avaluar el possible efecte sinèrgic de la co-infecció d’aquest amb altres entitats virals a nivel ultraestructural. Les fulles infectades únicament amb ToTV no van presentar grans alteracions cel?lulars, malgrat que es van a observar cossos d’inclusió contenint partícules virals isomètriques a les fulles parenquimàtiques del floema. Els teixits amb infeccions dobles de ToTV i PepMV, o ToTV i Tomato chlorosis virus (ToCV) presentaven majors alteracions. No obstant, l’efecte més perjudicial per als teixits va ser el causat per l’infecció triple de ToCV, PepMV i Tomato spotted wilt virus (TSWV), on es va observar un engrossiment clar de la paret cel?lular acompanyat d’una gran quantitat de cèl?lules necrosades. Finalment, es va estudiar la variabilitat genètica de denou aïllats espanyols de ToTV recollits en diverses àrees productores de tomaca del país, al llarg de nou anys. Al estudi també es van incluir tres aïllats hongaresos del virus. Es van estudiar cinc regions del genoma del virus: proteasa-cofactor, la RNA polimerasa RNA dependent, la proteïna del moviment i dos subunitats de la proteïna de la càpside (Vp35 y Vp23). Tots els aïllats van presentar una gran similitud a totes les zones estudiades. Els aïllats filogenètics van revelar un únic grup que englobava a tots els aïllats estudiats del virus, separant-los d’altres virus del nou gènere proposat (Torradovirus). En canvi, a les dos subunitats de la CP es va observar un subgrup constituït per aïllats de Gran Canària i un aïllat procedent de S. nigrum recollit a Tenerife. Les regions estudiades eren sota una forta pressió de selecció negativa, havent-hi nou nucleòtids sota pressió de selecció negativa repartits entre diverses zones del genoma, i tan sols un a la zona de la proteasa-cofactor sota pressió de selecció positiva. Resum_________________________________________________________________ xii xi Resum