Estudio de la interacción entre naranjo amargo y el virus de la Tristeza de los Cítricos

La tristeza de los cítricos es una de las enfermedades de mayor importancia, tanto por los daños económicos que ha causado, como por los cambios que ha obligado a introducir en los sistemas de cultivo. Está causada por el virus de la tristeza de los cítricos (CTV), un closterovirus transmitido por pulgones y por injerto, que infecta el floema de plantas de la familia Rutaceae. Los síndromes causados por CTV incluyen i) decaimiento y muerte de plantas propagadas sobre patrón naranjo amargo, ii) acanaladuras en la madera, enanismo y mermas de producción en algunas variedades con independencia del patrón, y iii) amarilleo y enanismo de plantas francas de naranjo amargo, pomelo o limonero ("seedling yellows"). El genoma de CTV está formado por una cadena simple de RNA de polaridad positiva con 12 marcos abiertos de lectura que potencialmente codifican 19 proteínas y dos regiones no codificantes en los extremos 5' y 3'. Tres de las proteínas codificadas (p25, p20 y p23) actúan como supresores del silenciamiento en Nicotiana benthamiana y N. tabacum y al menos p23 parece estar implicada en la producción de síntomas, aunque los determinantes específicos de cada uno de los síndromes son aún desconocidos. Tampoco se conoce si la intensidad de los síntomas está relacionada con la acumulación viral o con otros factores.
Para ver si las diferencias de síntomas entre aislados en un mismo huésped o entre distintos huéspedes infectados con el mismo aislado estaban asociadas con la acumulación viral, se inocularon cuatro aislados con distintas características patogénicas en lima Mexicana (LM), Citrus macrophylla (CM), naranjo dulce (ND) y naranjo amargo (NA) y se estimó la carga viral mediante ELISA y RT-PCR cuantitativa a tiempo real en la primera brotación y al cabo de 9 meses. Las diferencias de carga viral observadas entre aislados y entre huéspedes, no estaban relacionadas con la virulencia, lo que sugiere que la intensidad de los síntomas inducidos por CTV no es una consecuencia directa de la acumulación viral. Asimismo, para todos los aislados se observó una pauta de acumulación distinta en NA y en los demás huéspedes que indica que NA ofrece una resistencia inicial a la invasión por CTV.
Con el fin de dilucidar si las diferencias en las pautas de acumulación viral de los aislados de CTV estaban relacionadas con variaciones en la actividad replicativa del virus o con diferencias en el silenciamiento génico mediado por RNA se estudió en las mismas combinaciones aislado/huésped la acumulación de los RNAs subgenómicos que expresan los genes p20 y p23  y de siRNAs específicos de CTV durante la infección viral. Se observó una cinética de acumulación viral paralela a la actividad replicativa. En las especies más susceptibles (LM, CM y ND) la mayor actividad replicativa y la máxima carga viral se detectaron en la primera brotación, mientras que en NA ambas aumentaron con el transcurso de la infección. Por otro lado, mientras en los huéspedes susceptibles se detectaron siRNAs de CTV en la primera brotación, la activación de el silenciamiento en NA fue mucho más tardía indicando que la resistencia inicial a la acumulación viral en este huésped no era consecuencia del silenciamiento sino probablemente de una interacción menos eficiente entre factores virales y del NA necesarios para la replicación/movimiento de CTV. Tampoco las diferencias entre las pautas de acumulación o de silenciamiento de los aislados en los distintos huéspedes pudieron asociarse con una capacidad supresora diferente de sus proteínas p23, ya que el ensayo mediante expresión transitoria en N. benthamiana no mostró diferencias apreciables entre las mismas.
	Posteriormente, se analizó en más detalle el tipo de limitaciones que ofrecía NA a la invasión sistémica de CTV examinando la distribución de distintos aislados del virus en plantas de semilla y las pautas de acumulación del virus y de siRNAs de CTV en la raíz y la copa de plantas propagadas sobre NA, citrange Carrizo (resistente a CTV) o ND (susceptible). Se observó que el NA presentaba una limitación al movimiento viral, tanto célula a célula como a larga distancia, que retrasaba la invasión sistémica y la acumulación viral en la copa de forma diferencial según los aislados del virus y el patrón utilizado. El virus se detectó inicialmente en la raíz y el nivel de acumulación del mismo afectaba la posterior carga viral en la copa, de forma variable según los aislados. La acumulación del aislado T385 estaba asociada  a la carga viral alcanzada inicialmente en la raíz, lo que sugiere que la raíz actuaría como reservorio viral para este aislado. 
Finalmente, el empleo de la tecnología de las micromatrices de cDNA permitió analizar a nivel transcriptómico la respuesta del naranjo amargo al inicio de la infección por CTV. Los datos obtenidos fueron congruentes con las hipótesis formuladas anteriormente: i) que en el NA parece haber un retraso en la activación de los mecanismos de defensa, probablemente como consecuencia del retraso en la acumulación viral, y ii) que este retraso parece debido a una limitación del movimiento célula a célula.