El trabajo incluido en esta tesis está encuadrado en un proyecto cuyo objetivo general es el desarrollo de un vector viral eficiente de expresión o silenciamiento de genes, basado en el virus del manchado foliar de los cítricos (Citrus leaf blotch virus, CLBV), que se pueda utilizar como una herramienta genética para: 1) evaluar de forma rápida la función de genes de cítricos u otros organismos que pudieran ser útiles para la mejora genética del cultivo y 2) para obtener plantas resistentes o tolerantes a patógenos y plagas de cítricos.
Para desarrollar un vector viral a partir del genoma de CLBV era necesario disponer de un clon infeccioso del virus y de métodos eficientes de inoculación del mismo en plantas de cítricos. Al inicio de este trabajo sólo se disponía de información sobre la construcción de un clon infeccioso del aislado T36 del virus de la tristeza de los cítricos (Citrus Tristeza virus, CTV) y de su inoculación en plantas de cítricos. El único sistema que permitió la infección con este clon fue la inoculación de transcritos de RNA del genoma del virus en protoplastos de Nicotiana benthamiana, seguido de una amplificación de los viriones generados en ellos mediante sucesivos pases a nuevos protoplastos y la inoculación mecánica de los mismos en cítricos. Para reproducir el sistema genético desarrollado con CTV, se construyó un clon infeccioso de cDNA del genoma completo de CLBV bajo el promotor T7 del fago lambda y se pusieron a punto protocolos para el aislamiento de protoplastos de N. benthamiana, N. occidentalis y cidro Etrog. CLBV replicó en protoplastos de las tres especies transfectados con viriones purificados, aunque el nivel de replicación fue muy bajo y sólo se detectó a partir de 4-5 días post inoculación (dpi), que es el tiempo máximo de supervivencia de los protoplastos en nuestras condiciones de trabajo. La multiplicación del virus en protoplastos inoculados con transcritos de CLBV fue menor, detectándose sólo en algunos experimentos de transfección de protoplastos de N. benthamiana. Finalmente, la inoculación mecánica directa de plantas de cítricos o de N. benthamiana y N. occidentalis con transcritos de RNA del virus fue infructuosa, a pesar de que estos transcritos eran capaces de infectar protoplastos. 
Antes de modificar el clon infeccioso de CLBV para convertirlo en un vector viral eficiente, era necesario conocer la estrategia de expresión del genoma viral y caracterizar las secuencias implicadas en el reconocimiento y promoción de la síntesis de los RNAs subgenómicos (sgRNAs) para poder duplicar un promotor y expresar genes o fragmentos de genes mediante la formación de un nuevo sgRNA. Los estudios para caracterizar in vivo las secuencias implicadas en la promoción de los sgRNAs de virus de plantas se realizaron mediante la inoculación de transcritos del virus en protoplastos. Sin embargo, como el nivel de acumulación de CLBV en protoplastos inoculados con transcritos era muy bajo resultaba imposible utilizar este sistema genético. En el laboratorio se disponía de un clon infeccioso del genoma completo de CLBV bajo el promotor 35S de CaMV (IC-CLBV). Con este clon hemos desarrollado un sistema genético para caracterizar el promotor del sgRNA de la cápsida de CLBV (CP-sgRNA) in vivo, introduciendo directamente el cDNA en las células mediante agroinfiltración de hojas de N. benthamiana. Para mapear el promotor del CP-sgRNA de CLBV se construyeron varios mutantes a partir del clon IC-CLBV mediante supresión de nucleótidos y mutagénesis dirigida. Los resultados obtenidos indican que la posible secuencia promotora del CP-sgRNA está comprendida entre los nucleótidos -67 y +50 con respecto al inicio de transcripción, por lo tanto sería suficiente una región nucleotídica igual o inferior a 117 nt para controlar la producción del CP-sgRNA. Sorprendentemente, la supresión de segmentos de tamaño creciente entre el inicio de traducción del gen de la CP y el inicio de transcripción del CP-sgRNA indujo mayor acumulación de dicho sgRNA, sugiriendo que esta secuencia podría modular negativamente la transcripción del CP-sgRNA. 
En la secuencia de CLBV, el hexanucleótido GAAAAG está presente en el extremo 5´ del gRNA y de los dos sgRNAs 3´ coterminales del virus. En este trabajo se estudió la importancia de esta secuencia en la síntesis del CP-sgRNA. Para ello se realizaron sustituciones y supresión de los distintos nucleótidos que la componen mediante mutagénesis dirigida. Las mutaciones del primer y segundo nucleótidos indujeron una disminución drástica en la acumulación del CP-sgRNA, sugiriendo que juegan un papel importante en el reconocimiento por parte de la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) de CLBV para la transcripción del CP-sgRNA. Por otra parte, la supresión de una A en el hexanucleótido o las mutaciones de la G (+6) no alteraron la acumulación del CP-sgRNA, sugiriendo que dichos nucleótidos no son esenciales para el reconocimiento por la RdRp.
Por otro lado, para contrarrestar el mecanismo de defensa de las plantas activado durante la infección viral, que está basado en el silenciamiento génico postranscripcional, muchos virus de plantas expresan proteínas supresoras que inhiben este silenciamiento a distintos niveles. Los virus con supresores muy potentes se pueden usar como vectores de expresión pero no son adecuados para su uso como vectores de silenciamiento porque el supresor podría interferir con la maquinaria de silenciamiento de la planta, impidiendo el silenciamiento del gen a estudiar. El estudio de los supresores de silenciamiento de CLBV mostró que únicamente la proteína de movimiento del virus fue capaz de suprimir el PTGS (Post-transcriptional gene silencing) a nivel intracelular, pero no célula a célula ni a larga distancia. Esta proteína mostró una capacidad de supresión débil en comparación con otras proteínas de actividad supresora conocida. La proteína supresora del silenciamiento de CLBV actúa interfiriendo con la maquinaria del silenciamiento después de la generación de los siRNAS (pequeños RNAs interferentes).