El treball inclòs en aquesta tesi està enquadrat dins d'un projecte que té com objetiu principal el desenvolupament d'un vector viral eficient d'expressió o silenciament de gens, basat en el virus del tacat foliar dels cítrics (CLBV), que es puga utilitzar com una ferramenta genètica per : 1) avaluar de forma ràpida la funció de gens de cítrics o altres organismes que pogueren ser útils per a la millora genètica del cultiu i 2) obtindre plantes resistents o tolerants a patògens i plagues de cítrics.
        Per al desenvolupament d’un vector viral a partir del genoma de CLBV era necessari disposar d'un clon infecciós del virus i de mètodes eficients per la seua inoculació  en plantes de cítrics. A l'inici d'aquest treball només es disposava d'informació sobre l’obtenció d'un clon infecciós de l'aïllat T36 del virus de la tristesa dels cítrics (CTV) i de la seua inoculació en plantes de cítrics. L'únic sistema que va permetre la infecció amb aquest clon va ser la inoculació de transcrits del genoma del virus en protoplasts de N. benthamiana, seguit d'una amplificació dels virions generats en ells per mitjà de successius passes a nous protoplasts i la seua inoculació mecànica en cítrics. Per reproduir el sistema genètic desenvolupat amb CTV, es va construir un clon infecciós de cDNA del genoma complet de CLBV sota el promotor T7 del fag lambda i es va posar a punt protocols per l'aïllament de protoplasts de N. benthamiana, N. occidentalis i cidro Etrog. CLBV va replicar en protoplasts de les tres espècies transfectades amb virions purificats, encara que el nivell de replicació va ser molt baix i només es va detectar a partir de 4-5 dies post inoculació (dpi), coincidint amb el temps màxim de supervivència dels protoplasts en les nostres condicions de treball. La multiplicació del virus en protoplasts inoculats amb transcrits de CLBV va ser menor, detectant-se només en alguna de les transfeccions de protoplasts de N. benthamiana. Finalment, la inoculació mecànica directa de plantes de cítrics o de N. benthamiana i N. occidentalis amb transcrits del virus va ser infructuosa, encara que aquestos eren capaços d'infectar protoplasts. 
        Abans de modificar el clon infecciós de CLBV per a convertir-ho en un vector viral eficient, era necessari conéixer  l'estratègia d'expressió del genoma viral i caracteritzar les seqüències implicades en el reconeixement i  la síntesi dels RNAs subgenòmics (sgRNAs) per tal de  poder duplicar el promotor i expressar gens o fragments de gens per mitjà de la formació d'un nou sgRNA. La majoria dels estudis per a caracteritzar in vivo les seqüències implicades en la síntesi dels sgRNAs de virus de plantes  han   utilitzat la inoculació de transcrits del virus en protoplasts. En el nostre cas, com que el nivell d'acumulació de CLBV en protoplastos inoculats amb transcrits era molt baix resultava impossible utilitzar aquest sistema genètic. En el laboratori es disposava d'un clon infecciós del genoma complet de CLBV sota el promotor 35S de CaMV (IC-CLBV). Amb aquest clon hem desenvolupat un sistema genètic per a caracteritzar el promotor del sgRNA de la càpsida de CLBV (CP-sgRNA) in vivo, introduint directament el cDNA en les cèl•lules per mitjà d'agroinfiltració de les fulles de N. benthamiana. Per al mapatge el CP-sgRNA de CLBV es van construir diversos mutants a partir del clon IC-CLBV per mitjà de supressió de nucleòtids i mutagènesi dirigida. Els resultats obtinguts indiquen que la possible seqüència promotora del CP-sgRNA està compresa entre els nucleòtids -67 i +50 respecte a l'inici de transcripció, per tant seria suficient una regió nucleotídica igual o inferior a 117 nt per a controlar la producció del CP-sgRNA. Sorprenentment, la supressió de segments de grandària creixent entre l'inici de traducció del gen de la CP i l'inici de transcripció del CP-sgRNA va induir major acumulació del dit sgRNA, suggerint que aquesta seqüència podria modular la transcripció del CP-sgRNA. 
        En la seqüència de CLBV, l'hexanucleòtid GAAAAG està present en l'extrem 5´ del gRNA i en els dos sgRNAs 3´ coterminals del virus. En aquest treball es va estudiar la importància d’ aquesta seqüència en la síntesi del CP-sgRNA. Per a això es van realitzar mutacions i supressió dels diferents nucleòtids que la componen per mitjà de mutagènesi dirigida. Les mutacions del primer i segon nucleòtid van induir una disminució dràstica de l'acumulació del CP-sgRNA, suggerint que aquestos nucleòtids juguen un paper important en el reconeixement per part de la polimerasa (RdRp) de CLBV per a la transcripció del CP-sgRNA. D'altra banda, la supressió d'una A en l'hexanucleòtid o les mutacions de la G (+6) no van alterar l'acumulació del CP-sgRNA, suggerint que aquestos nucleòtids no són essencials per al reconeixement de la RdRp.
        Com a contradefensa al mecanisme de defensa de les plantes davant de la infecció viral basat en el silenciament gènic postranscripcional, molts virus de plantes expressen proteïnes que inhibixen aquest silenciament a diferents nivells. Els virus que codifiquen supressors molt potents es poden usar com a vectors d'expressió però no són adequats per al seu ús com a vectors de silenciament (VIGS) ja que el supressor podria interferir amb la maquinària de silenciament de la planta (PTGS), impedint el silenciament del gen a estudiar. L'estudi dels supressors de silenciament de CLBV va mostrar que únicament la proteïna de moviment del virus era capaç de suprimir el PTGS a nivell intracel•lular, però no cèl•lula a cèl•lula ni a llarga distància. Aquesta proteïna va mostrar una capacitat de supressió dèbil en comparació amb altres proteïnes d'activitat supressora coneguda. La proteïna supressora del silenciament de CLBV actúa interferint amb la maquinària del silenciament després de la generació dels siRNAS (xicotets RNAs interferents).