Caracterización molecular y desarrollo de métodos de diagnóstico del género Fabavirus. Evaluación de BTH como método de control.

       El género Fabavirus pertenece a la familia Comoviridae e incluye tres especies: Broad bean wilt virus 1 (BBWV-1), BBWV-2 y Lamium mild mosaic virus (LMMV), aunque recientemente se ha propuesto una nueva especie, Gentian mosaic virus (GeMV). Estos virus afectan a un gran número de especies hortícolas y ornamentales y son transmitidos de manera no persistente por unas veinte especies de pulgones. El genoma está formado por dos cadenas de RNA monocatenario de polaridad positiva que se encapsidan separadamente con dos proteínas de cápsida formando viriones isométricos. BBWV-1 y BBWV-2 están distribuidos por todo el mundo. En España se ha encontrado BBWV-1 en cultivos de pimiento de Aragón, Cataluña, Castilla León, C. Valenciana, Murcia, Navarra, País Vasco y La Rioja.
Los fabavirus son un grupo viral muy poco estudiado. Al comienzo de esta tesis, sólo se había determinado la secuencia nucleotídica del genoma completo de seis aislados de BBWV-2 procedentes de Extremo Oriente, mientras que no se disponía de ninguna secuencia completa de BBWV-1. Para desarrollar métodos rápidos, sensibles y específicos de detección, diferenciar aislados con secuencias divergentes y evaluar en su caso la efectividad de distintas estrategias de control se consideró necesario obtener la secuencia completa de al menos un aislado de BBWV-1 y secuencias parciales de  aislados de distintos países.  En esta tesis, se determinó la secuencia nucleotídica completa del genoma del aislado español 1S1 de BBWV-1 y se dedujo su organización genómica. El genoma está formado por dos moléculas de RNA monocatenario de polaridad positiva de 5814 y 3431 nt, respectivamente, con la organización genómica descrita para otros miembros de la familia Comoviridae. Al comparar esta secuencia con la única secuencia disponible de BBWV-1 correspondiente al aislado 1U2 de EEUU (publicado durante el desarrollo de esta tesis), se comprobó que los genomas de ambos aislados eran muy divergentes, presentando una indentidad nucleotídica aproximada del 80% y aminoacídica del 92%. 
	El alineamiento de la secuencia nucleotídica completa de los dos aislados de  BBWV-1, seis de BBWV-2 y uno de GeMV se utilizó para diseñar cuatro pares de iniciadores conservados que se usaron para obtener mediante retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) secuencias parciales de  aislados de BBWV-1 y BBWV-2 de distintas procedencias. El análisis de estas secuencias y de otras obtenidas de la base de datos GenBank sirvió para estimar la variabilidad genética del género Fabavirus. Los resultados revelaron una elevada diversidad genética en BBWV-1 y BBWV-2 en comparación con otros virus vegetales. Se encontraron evidencias de eventos de recombinación, variaciones en la presión selectiva a lo largo del genoma y sucesos de migración a larga distancia.
	Se desarrollaron nuevas técnicas de diagnóstico basadas en la hibridación molecular con extractos de RNA o improntas de tejido (formatos dot-blot y tissue-print, respectivamente) o en RT-PCR y se evaluó su sensibilidad para la detección de BBWV-1 y BBWV-2 en distintos huéspedes y tejidos en comparación con ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
	El análisis comparativo de secuencias nucleotídicas permitió diseñar: A) Un método para detectar BBWV-1, BBWV-2 y GeMV mediante RT-PCR usando un único par de iniciadores conservados; B) Un método para detectar todos los aislados de BBWV-1 o BBWV-2 mediante hibridación con sondas correspondientes a una zona genómica conservada y, C) Un método para diferenciar grupos de aislados de cada especie viral, mediante la hibridación molecular con sondas específicas correspondientes a una zona más variable. 
	Por último, en este trabajo se evaluó el efecto del S-metil benzo[1,2,3]tiadiazol-7-carbotioato (BTH) en el control de la enfermedad. La aplicación de este compuesto en plantas de Arabidopsis thaliana inoculadas con BBWV-1 indujo un retraso en la acumulación del virus (detectado mediante RT-PCR e hibridación molecular) y en la manifestación de los síntomas. Estos resultados parecen indicar que los tratamientos con BTH pueden ser eficaces para el control de BBWV-1. Este método es respetuoso con el medio ambiente y presenta un amplio espectro de acción,  lo que resultaría apropiado para el control de fabavirus considerando su gran variabilidad genética.