RESUMEN En este trabajo de tesis, se presentan diversos estudios experimentales, desarrollados principalmente en pez cebra pero también en ostra del Pacífico, que persiguen la puesta a punto de técnicas relevantes para la utilización de estas dos especies en el campo de la biomedicina, la toxicogenómica y la acuicultura como modelo experimental. En pez cebra, se han puesto a punto y testado: ? Técnicas de vitrificación de tejido de aleta caudal, de blastómeras (en microvolúmenes) y de tejido gonadal. ? Técnica de quimerismo de la línea germinal en estadio MBT, con una penalización previa por radiación ultravioleta de los embriones receptores. ? Técnica de quimerismo larvario (larvas de 48-72 h) utilizando como donantes células testiculares obtenidas de individuos adultos y previamente criopreservadas. ? Técnica de transplante nuclear utilizando como donantes núcleos de células somáticas adultas y larvarias. ? Técnica de electroactivación en medio iónico de oocitos de pez cebra. In ostra del Pacífico, se han puesto a punto y testado: ? Evaluación de los cambios estacionales en la calidad oocitaria y espermática en ostra del Pacífico. ? Técnica de electrofusión cigótica de cigotos obtenidos por fecundación in vitro en ostra del Pacífico. Técnicas de vitrificación de tejido de aleta caudal, de blastómeras (en microvolúmenes) y de tejido gonadal. En relación con este grupo de técnicas, señalar el diferente nivel de dificultad de cada una de ellas e incluso de los resultados alcanzados. Así, la vitrificación de tejido de la aleta caudal no ha supuesto problema adicional respecto a la aplicación de dicha técnica en los últimos años a tejidos epiteliales de cinco especies de mamíferos, lo que da idea de la versatilidad en el uso de dicha técnica de vitrificación básica. Por contra, la criopreservación de blastómeras ha supuesto un verdadero reto, ya que los patrones de permeabilidad celular en esta especie acuática es muy diferente a la característica en mamíferos, lo que obliga en principio y siguiendo los métodos de vitrificación más convencionales (permeación intracelular de crioprotectores), a prolongar excesivamente los tiempos de permeación previos a la vitrificación. Ha sido resultado de un enfoque innovador el que se haya logrado la vitrificación de blastómeras aisladas con relativamente elevada viabilidad celular posterior, cuando la vitrificación se realizó en microvolúmenes (0.25µl) y sin pretender la permeación del crioprotector al interior de las células. Por lo que se refiere a la criopreservación de tejido gonadal, se han testado tres procedimientos, dos de congelación y uno de vitrificación, de los que claramente éste último mejores resultados ha supuesto. Ciertamente, el procedimiento de vitrificación ha resultado mucho más eficiente cuando se ha aplicado sobre pequeños fragmentos de tejido testicular que cuando se aplicó después de su tripsinización. Técnica de quimerismo de la línea germinal en estadio MBT, con una penalización previa por radiación ultravioleta de los embriones receptores. Respecto a las técnicas de quimerismo de la línea germinal en estadio MBT, deben señalarse diversas cuestiones. En primer lugar, que el tratar los embriones receptores con radiación ultravioleta (UV), no es el único requisito para lograr los mejores resultados de quimerismo de la línea germinal, debiendo complementarse dicho efecto con la evitación del choque osmótico que supone la utilización de medios de 30 mOsm/kg para la micromanipulación. De otro lado, es relevante señalar la detección de una sensibilidad diferencial al tratamiento por UV en función de la estirpe de pez cebra utilizada, siendo la estirpe gold más sensible que la wild a este respecto. Por lo que se refiere a la técnica de quimerismo utilizando blastómeras vitrificadas en microvolúmenes, deberán asimismo resolverse en el futuro la desorganización morfológica del embrión receptor provocada por el aumento de tamaño tras su desvitrificación de las blastómeras y el consiguiente tamaño excesivo de las pipetas de micromanipulación. Técnica de quimerismo larvario (larvas de 48-72 h) utilizando como donantes células testiculares obtenidas de individuos adultos y previamente criopreservadas. Esta técnica es la consecuencia lógica de la criopreservación de tejido testicular indicada antes, puesto que se requiere para que dichas células testiculares, concretamente las espermatogónias, se integren en la línea germinal del individuo receptor. Se han utilizado larvas de 48-72 h asumiendo que en dicho estadio el sistema inmunitario no se ha establecido plenamente y, por tanto, no atacará las células transplantadas. Los resultados técnicos relativos a micromanipulación, supervivencias larvarias y desarrollo hasta adulto han sido plenamente satisfactorios, no así los de quimerismo de la línea germinal, ya que no se ha observado quimerismo de la línea germinal en ningún espécimen. De entre las razones que justificarían esta carencia, una resalta como más plausible a juicio de los autores, siendo ésta la posible disincronía entre las pautas temporales de desarrollo de las espermatogonias y aquellas propias del tejido testicular, al parecer más rápidas que lo primero. Técnica de transplante nuclear utilizando como donantes núcleos de células somáticas adultas y larvarias. Es este grupo de técnicas quizás más original y de mayor recorrido de cara al futuro de entre las aquí contempladas. Las aportaciones que a este respecto se han logrado con esta tesis podrían clasificarse en varios ítems. En primer lugar, el haber logrado el transplante nuclear sobre oocitos no activados sin necesidad de localizar el micropilo, siendo además que en ninguna de las tres alternativas de transplante nuclear se ha requerido el decorionado de los oocitos receptores. En segundo lugar, haber podido comparar los efectos que sobre el desarrollo embrionario posterior y el alcance del mismo tienen en cualesquiera de estas alternativas de transplante nuclear el que el oocito haya sido activado mediante su fertilización con un espermatozoide no radiado, con uno radiado o tan solo por el efecto estimulante del contacto con el agua de sistema. A este mismo respecto, señalar que la punción de la pipeta de transplante nuclear como la mera exposición a agua de sistema sin insertar núcleo celular alguno, no suponen en ningún caso el desarrollo posterior partenogenota, lo que nos permite afirmar el papel relevante que la presencia del núcleo donante ejerce sobre la capacidad de desarrollo embrionario. En tercer lugar se ha podido desestimar la posible utilidad del envejecimento oocitario como factor promotor de la eficacia de activación oocitaria, a diferencia, en este caso notable, de lo conocido en mamíferos. Mención especial merece una aproximación al estudio del imprinting gamético e incluso de posible técnica alternativa para la obtención de animales transgénicos, que se deriva de la utilización como donante en transplante nuclear, sobre oocito no enucleado, de células obtenidas por cultivo de larvas ginogenotas haploides obtenidas por radiación ultravioleta de espermatozoides. La potencial importancia de esta técnica sólo ha podido ser evaluada muy preliminarmente en esta tesis, aunque en estos momentos ya se están desarrollando nuevos trabajos al respecto. Técnica de electroactivación en medio iónico de oocitos de pez cebra. Respecto a esta técnica, lo más relevante que se deriva de estos estudios sea quizás la facilidad que supone el poder utilizar medios iónicos para electroactivación, máxime siendo que en prácticamente todos los experimentos de electroactivación recientes de los que se tiene conocimiento, el medio de electroactivación ha sido masivamente no conductor. De otro lado, el mejor protocolo de electroactivación (un pulso cuadrado de 5.4 V y 20µs de duración) permite hasta un 60 % de oocitos activados cuando estos no han sido previamente micromanipulados. Desafortunadamente cuando estas secuencias de pulsos se ensayaron sobre oocitos transplantados nuclearmente, la casi totalidad de ellos resultaron lisados. Esto obligará en el futuro a redefinir los pulsos eléctricos cuando se pretendan acoplar a la técnica de transplante nuclear. Evaluación de los cambios estacionales en la calidad oocitaria y espermática en ostra del Pacífico. Aunque este apartado no se refiere al desarrollo de técnica de micromanipulación alguna, resultaba imprescindible conocer los meses del año en los que se dispondría de gametos en cuantía y calidad suficiente para, precisamente, poder trabajar en técnicas embriológicas o de micromanipulación en esta especie. Los resultados han sido absolutamente concluyentes, de tal forma que sólo en los meses de Julio a Octubre, ambos inclusive cabe esperar que se disponga de gametos, mientras que en el resto del año tal disponibilidad resulta cuando menos incierta. Técnica de electrofusión cigótica de cigotos obtenidos por fecundación in vitro en ostra del Pacífico. En base a lo anterior, durante los meses señalados, se realizaron ensayos de electrofusión zigótica como paso previo a la posible obtención de ostras tetraploides. A este respecto, varios de los resultados obtenidos han resultado interesantes. De un lado, y con visos de poderse extender a otras especies marinas, se ha comprobado que la aplicación de pulsos eléctricos (en este caso de fusión celular) puede darse en medios altamente conductores y de elevada osmolaridad, en este caso agua de mar. De otro lado, la tasa de fusión celular en estadio zigótico ha sido altamente eficiente, con unas mortalidades sumamente reducidas y con elevadas tasas de desarrollo hasta larva de estadio D (24 h de cultivo post-fusión). También se ha podido comprobar que la fusión no altera de manera significativa los patrones de divisiones celulares posteriores, transcurridos 25-30 min de aplicación del pulso, lo que indicaría la práctica ausencia de daños ocasionados por el pulso sobre los embriones tempranos. La no disponibilidad de las instalaciones y alimento requeridos para que el grado de desarrollo alcance estadios clave como “spat” e incluso adulto impide, por ahora, evaluar la ploidía de los especimenes así obtenidos.