Resumen Los ácidos biliares son esteroides biosintetizados en el hígado que actúan como tensoactivos, formando micelas mixtas con colesterol y otros lípidos para facilitar su digestión. Con este fin, los ácidos biliares viajan hasta el intestino, donde se separan de los lípidos ingeridos y vuelven al hígado para ser reutilizados en un movimiento conocido como circulación enterohepática. El ácido biliar más abundante es el ácido cólico, seguido por desoxicólico y quenodesoxicólico. Se encuentran mayoritariamente conjugados con glicina o taurina y así incrementan su solubilidad en agua a pH fisiológico. La circulación enterohepática es un proceso muy complejo en el que no todas las etapas están perfectamente entendidas. Además pueden suceder alteraciones y como consecuencia, problemas de toxicidad, ya que los ácidos biliares en concentraciones muy altas son citotóxicos. Una de estas alteraciones es la colestasis, que comprende todas las situaciones en las cuales existe una alteración en el flujo normal de la bilis desde el polo canalicular del hepatocito hasta el duodeno. La colestasis puede estar inducida por fármacos, lo que usualmente implica su retirada del mercado. En la presente tesis doctoral se planteó preparar derivados fotoactivos de ácidos biliares para estudiar varios aspectos relacionados con la circulación enterohepática, en concreto para estudiar las interacciones con albúmina sérica humana, el transportador mayoritario de los ácidos biliares en la última etapa de la circulación enterohepática; y por otra parte estudiar el comportamiento de los ácidos biliares con modelos celulares para detectar efectos colestásicos de fármacos. En primer lugar se optimizaron las rutas sintéticas que permitieron obtener regio- y estereoselectivamente amino derivados de ácido cólico en las posiciones 3a, 3b, 7a o 7a. Estos intermedios resultaron muy versátiles, ya que pudieron ser conjugados con fluoróforos como nitrobenzofurazano, dansilo, carprofeno, anhídrido-aminoftálico y bimano. Se utilizó también la aminofluoresceína, que se unió por el grupo carboxílico del ácido cólico. Además, se prepararon dos compuestos modelo más sencillos con los fluoróforos aminofluoresceína y nitrobenzofurazano. Por último, también se prepararon dos derivados fluorescentes de otros ácidos biliares, el taurocolato y el ácido litocólico, con el fluoróforo nitrobenzofurazano. A continuación, se estudiaron sus propiedades fotofísicas. Así, los derivados de aminofluoresceína mostraron una gran dependencia del pH. Se observó absorción en la zona visible y fluorescencia verde, con un rendimiento cuántico muy alto. Se mostraron eficientes como sondas de CO2 y se observó la formación del estado excitado triplete con un máximo a 520 nm. Los derivados de nitrobenzofurazano absorbieron en la zona visible y exhibieron fluorescencia verde, con un rendimiento cuántico elevado. Estas características se vieron influenciadas por la naturaleza del medio, ya que en disolventes más hidrofílicos se observó un desplazamiento de los máximos de absorción y emisión hacia el rojo y una disminución tanto del rendimiento cuántico como del tiempo de vida de singlete. Por primera vez, ha sido observado y caracterizado su estado excitado triplete con un máximo a 390 nm, confirmado por experimentos de transferencia de energía al b-caroteno. Los derivados de dansilo mostraron absorción en la zona UV y fluorescencia verde. Su emisión fue influenciada por la hidrofobicidad de disolvente, efecto que se manifestó en un desplazamiento hacia el rojo con disminución del rendimiento cuántico de fluorescencia y del tiempo de vida en disolventes más polares. La presencia de oxígeno causó una disminución de la emisión y acortamiento del tiempo de vida, un proceso controlado por difusión. El espectro de absorción transitoria mediante fotólisis de destello láser mostró una banda con un máximo a 400 nm, que se asignó a un catión radical de dansilo en base a que no se desactivaba por oxígeno y a que su formación se favorecía en presencia de un buen electrón aceptor, el CCl4. Mediante medidas de fluorescencia en presencia de CCl4 se confirmó que el catión radical se formaba a partir del singlete. Por último, el estudio del resto de los derivados fotoactivos de ácido cólico se limitó a sus propiedades fotofísicas del estado singlete más importantes. Las interacciones de los derivados de nitrobenzofurazano con albúmina sérica humana, estudiadas por absorción y fluorescencia, demostraron que se formaban complejos de estequiometría 1:1. Los cambios en absorción y emisión debidos a la presencia de HSA permitieron calcular las constantes de asociación para los complejos formados (del orden de 104 M-1). Por otra parte, gracias a la transferencia de energía observada entre el triptófano de HSA y el nitrobenzofurazano de los derivados se pudieron calcular las distancias entre ambos en los complejos (27-30 Å). Finalmente, mediante experimentos de desplazamiento con sondas específicas, se comprobó que el sitio de unión para estos derivados era el sitio 1. Experimentos adicionales con un compuesto modelo conteniendo el fluoróforo permitieron concluir que la preferencia de los derivados de ácidos biliares por el sitio 1 era debida al esqueleto de esteroide. La emisión y tiempos de vida de fluorescencia de los derivados de dansilo aumentaba en presencia de HSA, lo que permitió de nuevo calcular las constantes de asociación y distribución en la HSA para los complejos formados Dns-ChA@HSA, donde los derivados C-3 presentaban dos constantes de afinidad del orden de ca. 105 y 104 M-1, mientras que los derivados C-7 una sola constante del orden de 104 M-1. Gracias a la transferencia de energía observada entre el triptófano de HSA y el fluoróforo Dns, asumiendo un mecanismo de Förster, se pudieron estimar las distancias entre ambos, que fueron 21-25 Å. Experimentos adicionales de desplazamiento, utilizando sondas específicas manifestaron ocupación mayoritaria del sitio 2 por los derivados C-3, mientras que los derivados C-7 se comportaron como los derivados de nitrobenzofurazano, es decir mostraron afinidad al sitio 1. Finalmente, en experimentos de desplazamiento por dos ácidos biliares naturales, se confirmó la afinidad del ácido litocólico por el sitio 2. A partir de estos resultados se puede concluir que los derivados C-3 son análogos fluorescentes del ácido litocólico y los C-7 análogos del ácido cólico natural. Se estudió la captación de algunos derivados fluorescentes de ácido cólico por suspensiones de hepatocitos, utilizando la técnica de citometría de flujo. Primero, se demostró que CamF fue captado específicamente por los hepatocitos vivos más lentamente que por las células muertas y que esta captación dependía de la concentración. Estos experimentos permitieron poner a punto la técnica y optimizar las condiciones experimentales para otros estudios más detallados. A continuación se estudiaron las cinéticas de transporte de los derivados de nitrobenzofurazano que mostraron ser captados específicamente por los hepatocitos vivos, siendo 3a-NBD-ChA el derivado más eficiente. Se detectó y cuantificó el incremento de fluorescencia correspondiente al fluoróforo dentro de las células vivas; esta técnica se pudo extender a la detección y cuantificación de los efectos de inhibición por fármacos colestásicos. Se observó una inhibición en la captación de 3a-NBD-ChA por troglitazona, clorpromazina, ciclosporina A y valproato sódico, en buena correlación con su potencial colestásico in vivo. Finalmente, los derivados de dansilo en ensayos citométricos se comportaron de manera análoga, siendo 3a-Dns-ChA el derivado el más eficiente en la captación por los hepatocitos; de nuevo se observó el efecto inhibidor de troglitazona para los cuatro derivados.