Resum
	Els àcids biliars són esteroides biosintetitzats en el fetge que actuen com a tensioactius, formant micel·les mixtes amb colesterol i altres lípids per tal de facilitar la seva digestió. Amb aquesta finalitat, els àcids biliars viatgen fins a l’intestí, i allà se separen dels lípids ingerits i tornen al fetge per tal de ser reutilitzats en un moviment conegut com a circulació enterohepàtica. L’àcid biliar més abundant és l’àcid còlic, seguit del desoxicòlic i el quenodesoxicòlic. Tots aquests es troben majoritàriament conjugats amb glicina o taurina i d’aquesta manera incrementen la seva solubilitat en aigua a pH fisiològic. La circulació enterohepàtica és un procés molt complex en el qual no totes les etapes són perfectament enteses. A més, poden tenir lloc alteracions i, com a conseqüència d’aquestes, problemes de toxicitat, ja que els àcids biliars són citotòxics a concentracions molt altes. Una de les alteracions més rellevants és la colèstasi, que comprén totes les situacions en les quals existeix una alteració del flux normal de la bilis des del pol canalicular de l’hepatocit fins al duodè. La colèstasi pot estar induïda per fàrmacs, i això usualment implica la retirada del mercat d’aquestos.
	En la present tesi doctoral es plantejà, d’una banda, preparar derivats fotactius d’àcids biliars per tal d’estudiar diversos aspectes relacionats amb la circulació enterohepàtica, concretament les interaccions amb albúmina sèrica humana, que és el transportador majoritari dels àcids biliars en l’última etapa de la circulació enterohepàtica; i, d’una altra, estudiar el comportament d’aquestos amb models cel·lulars i així detectar efectes colestàsics de fàrmacs.
	Per fer això, en primer lloc s’optimitzaren les rutes sintètiques que permeteren obtindre regioselectivament i estereoselectivament aminoderivats d’àcid còlic en les posicicons 3a, 3b, 7a i 7b. Aquests intermedis resultaren ser molt versàtils, ja que pogueren ser conjugats amb fluoròfors com nitrobenzofurazà, dansil, carprofè, aminoftalimida i bimà. S’utilitzà també l’aminofluoresceïna, la qual s’uní pel grup carboxílic de l’àcid còlic. A més, es prepararen dos compostos model més senzills amb els fluoròfors aminofluoresceïna i nitrobenzofurà. Per últim, també es prepararen dos derivats fluroescents d’altres àcids biliars: el taurocolat i l’àcid litocòlic amb el fluoròfor nitrobenzofurà.
	A continuació s’estudiaren les propietats fotofísiques d’aquests compostos. Així, els derivats d’aminofluoresceïna mostraren una gran dependència del pH. S’observà que presentaven absorció en la zona visible i fluorescència verda, amb un rendiment quàntic molt alt. Es mostraren eficients com a sondes de CO2 en EtOH. A més, s’observà la formació de l’estat excitat triplet amb un màxim a 520 nm. Els derivats de nitrobenzofurazà absorbiren en la zona del visible i exhibiren fluorescència verda, amb un rendiment quàntic elevat. Aquestes característiques es veieren influenciades per la naturalesa del medi, ja que en dissolvents més hidrofílics s’observà un desplaçament dels màxims d’absorció i emissió cap al roig i una disminució tant del rendiment quàntic com del temps de vida del singlet. Per primera vegada, ha estat observat i caracteritzat l’estat excitat triplet d’aquests compostos amb un màxim a 390 nm, confirmat per experiments de transferència d’energia al b-carotè. Els derivats de dansil mostraren absorció en la zona ultraviolada i fluorescència verda. La seva emissió fou influenciada per la hidrofobicitat del dissolvent, efecte que es manifestà en un desplaçament cap al roig i amb una disminució del rendiment quàntic de fluorescència i del temps de vida en dissolvents més hidrofílics. La presència d’oxigen causà una disminució de l’emissió i un acurtament del temps de vida, un procés controlat per difusió. L’espectre d’absorció transitòria obtingut mitjançant fotòlisi de flaix làser mostrà una banda amb un màxim a 400 nm, que s’assignà a un catió radical del dansil ja que no es desactivava per oxigen i que la seva formació s’afavoria en presència d’un bon acceptor d’electrons, el CCl4. Mitjançant mesures de fluorescència en presència de CCl4, es confirmà que el catió radical es formava a partir del singlet. Per últim, pel que fa a la resta dels derivats fotoactius d’àcid còlic, només s’estudiaren les propietats fotofísiques més importants del seu estat singlet.
	Les interaccions dels derivats de nitrobenzofurazà amb albúmina sèrica humana estudiades per absorció i fluorescència, demostraren que es formaven complexos d’estequiometria 1:1. Els canvis en l’absorció i l’emissió deguts a la presència de l’HSA permeteren calcular les constants d’associació per als complexos formats (que eren de l’ordre de 104 M-1). D’altra banda, gràcies a la transferència d’energia observada entre el triptòfan de l’HSA i el nitrobenzofurazà dels derivats, es pogueren calcular les distàncies entre ambdós en els complexos (27-30 Å). Finalment, mitjançant experiments de desplaçament amb sondes específiques, es comprovà que el lloc d’unió per a aquests derivats era el lloc 1. Experiments addicionals amb un compost model contenint el fluoròfor, permeteren concloure que la preferència dels derivats d’àcids biliars pel lloc 1 era deguda a l’esquelet esteroide. L’emissió i temps de vida de fluorescència dels derivats de dansil augmentava en presència d’HSA, el que va permetre de nou calcular les constants d’associació i distribució en l’HSA per als complexes formats Dns-ChA@HSA, on els derivats C-3 presentaven dos constants d’afinitat de l’ordre de ca. 105 i 104 M-1, mentre que els derivats C-7 presentaven una sola constant de l’ordre de 104 M-1. Gràcies a la transferència d’energia observada entre el triptòfan de l’HSA i el fluoròfor Dns, assumint un mecanisme de Förster, s’estimaren les distàncies entre ambdós que foren 21-25 Å. Experiments addicionals de desplaçament utilitzant sondes específiques, manifestaren una ocupació majoritària del lloc 2 pels derivats C-3, mentre que els derivats C-7 es comportaren com els derivats de nitrobenzofurazà, es a dir, mostraren afinitat pel lloc 1. Finalment, en experiments de desplaçaments per dos àcids biliars naturals, es confirmà l’afinitat de l’àcid litocòlic pel lloc 2. A partir d’estos resultats es pot concloure que els derivats C-3 son anàlegs fluorescents de l’àcid litocòlic i els C-7 anàlegs de l’àcid còlic natural.
	S’estudià també la captació d’aguns derivats fluroescents d’àcid còlic per suspensions d’hepatocits, utilitzant la tècnica de citometria de flux. Primer es demostrà que CamF fou captat específicament pels hepatocits vius més lentament que per les cèl·lules mortes i que aquesta captació depenia de la concentració. Aquests experiments permeteren posar a punt la tècnica i optimitzar les condicions experimentals per a altres estudis més detallats. A continuació s’estudiaren les cinètiques de transport dels derivats de nitrobenzofurazà, que mostraren ser captats específicament pels hepatocits vius. El derivat 3a-NBD-ChA resultà ser el més eficient. Es detectà i quantificà l’increment de fluorescència corresponent al fluoròfor dins de les cèl·lules vives; aquesta tècnica es pogué estendre a la detecció i quantificació dels efectes d’inhibició per fàrmacs colestàsics. S’observà una inhibició en la captació de 3a-NBD-ChA per troglitazona, clorpromazina, ciclosporina A i valproat sòdic en bona correlació amb el seu potencial colestàsic in vivo. Finalment, els derivats de dansil aplicats per a assajos citomètrics es comportaren de manera anàloga. El derivat el 3a-Dns-ChA resultà ser més eficient en la captació pels hepatocits. S’observà de nou l’efecte inhibidor de troglitazona per als quatre derivats.