RESUMEN

Los fungicidas azólicos son plaguicidas ampliamente empleados en agricultura. Por motivos de seguridad alimentaria, es necesario disponer de métodos analíticos de los residuos de dichos plaguicidas en muestras agroalimentarias. Actualmente, la cromatografía es, indudablemente, el método más empleado para la determinación de residuos de plaguicidas en muestras agrícolas. Sin embargo, los métodos cromatográficos presentan ciertas limitaciones, relacionadas fundamentalmente con la complejidad de los instrumentos y con la laboriosidad de la preparación de las muestras. Como consecuencia, se han desarrollado nuevas técnicas de análisis, entre las que destacan los inmunoensayos, que ofrecen prestaciones analíticas más sencillas y rápidas. En la bibliografía se han descrito inmunoensayos frente a fungicidas azólicos, basados tanto en anticuerpos policlonales como en anticuerpos monoclonales. En los últimos años, los avances en biología molecular han permitido la obtención de la llamada tercera generación de anticuerpos, los anticuerpos recombinantes. No obstante, aunque la tecnología del DNA recombinante ha alcanzado un alto nivel de desarrollo para el caso de moléculas de elevado peso molecular, la obtención de anticuerpos recombinantes frente a moléculas orgánicas de bajo peso molecular, como es el caso de los plaguicidas, está bastante menos extendida.

Así pues, el objetivo principal de esta tesis es en la obtención de anticuerpos recombinantes frente a los fungicidas azólicos tetraconazol, hexaconazol e imazalil, y su aplicación en la determinación de residuos de estos fungicidas en muestras agroalimentarias. 

En primer lugar, se han aplicado técnicas de biología molecular para la obtención de los fragmentos recombinantes scFv (single chain fragment variable) a partir del material genético de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a los fungicidas tetraconazol, hexaconazol e imazalil. Posteriormente, dichos fragmentos se han expresado en sistemas bacterianos empleando vectores de expresión plasmídicos. Por otro lado, se ha optimizado un sistema de cribado y selección de colonias bacterianas productoras de fragmentos de anticuerpos recombinantes capaces de reconocer a los plaguicidas en estudio. Este sistema está basado en ELISAs simultáneos, competitivos y no competitivos, de la fracción soluble del anticuerpo recombinante. Finalmente, en el caso de los anticuerpos frente a hexaconazol e imazalil, se ha aplicado un protocolo de enriquecimiento cíclico denominado panning, basado en la tecnología de presentación de moléculas proteicas en la superficie de fagos (phage display). De este modo, se han obtenido anticuerpos recombinantes a partir de cada hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Cada anticuerpo recombinante se ha expresado tanto en su forma de proteína libre (scFv) como en forma de proteína de fusión (scFv-pIII).

De igual modo, se han empleado técnicas de biología molecular para la generación de bibliotecas de fragmentos recombinantes scFv a partir del material genético de linfocitos de ratones inmunizados frente a cada uno de los tres fungicidas. En este caso, se han optimizado las condiciones tanto de la etapa de construcción de bibliotecas como del posterior proceso de enriquecimiento por panning. De este modo, se ha obtenido un anticuerpo recombinante de alta afinidad frente a tetraconazol que se ha expresado tanto en su forma de proteína libre (scFv) como en forma de proteína de fusión (scFv-pIII). 

A continuación, se han comparado las características analíticas de los inmunensayos de tetraconazol, hexaconazol e imazalil, basados en anticuerpos monoclonales y en anticuerpos recombinantes, tanto scFv como scFv-pIII. En todos los casos, los inmunoensayos basados en anticuerpos monoclonales han resultado más sensibles que los inmunoensayos basados en anticuerpos recombinantes. En términos de especificidad, todos los anticuerpos recombinantes han mostrado un patrón de reconocimiento comparable al del anticuerpo monoclonal correspondiente. 

Finalmente, se han desarrollado ELISAs basados tanto en anticuerpos monoclonales como en anticuerpos recombinantes para la determinación de tetraconazol, hexaconazol e imazalil en muestras de zumos de fruta. Todos los inmunoensayos desarrollados han permitido la determinación rápida y sencilla del correspondiente fungicida con precisión y exactitud aceptables.