RESUM

Els fungicides azòlics són plaguicides àmpliament emprats en agricultura. Per motius de seguretat alimentària, cal disposar de mètodes per analitzar els residus dels esmentats plaguicides en mostres agroalimentàries. Actualment, la cromatografia és, sens dubte, el mètode més emprat per a la determinació de residus de plaguicides en mostres agrícoles. No obstant això, els mètodes cromatogràfics presenten una sèrie de limitacions relacionades fonamentalment amb la complexitat dels instruments i amb la preparació de les mostres. Com a conseqüència, s’han desenvolupat noves tècniques d’anàlisi, entre les quals destaquen els immunoassajos, els quals ofereixen prestacions analítiques més senzilles i ràpides. En la bibliografia s'han descrit immunoassajos davant fungicides azòlics, basats tant en anticossos policlonals com en anticossos monoclonals. En els últims anys, els avenços en biologia molecular han permès l'obtenció de la anomenada tercera generació d'anticossos, els anticossos recombinants. No obstant això, encara que la tecnologia del DNA recombinant ha assolit un alt nivell de desenvolupament per al cas de molècules d'elevat pes molecular, l'obtenció d’anticossos recombinants per a molècules orgàniques de baix pes molecular, com és el cas dels plaguicides, està molt menys estesa. 

Així doncs, l'objectiu principal d'aquesta tesi és l'obtenció d'anticossos recombinants per als fungicides azòlics tetraconazol, penconazol, hexaconazol i imazalil, i la seva aplicació en la determinació de residus d'aquests fungicides en mostres agroalimentàries.

En primer lloc, s'han aplicat tècniques de biologia molecular per a l'obtenció dels fragments recombinants scFv (single chain fragment variable) a partir del material genètic d'hibridomes productors d'anticossos monoclonals per als fungicides tetraconazol, hexaconazol i imazalil. Posteriorment, els esmentats fragments s'han expressat en sistemes bacterians emprant vectors d'expressió plasmídics. D'altra banda, s'ha optimitzat un sistema de garbellat i selecció de colònies bacterianes productores de fragments d'anticossos recombinants capaços de reconèixer als plaguicides en estudi. Aquest sistema està basat en ELISAs simultanis, competitius i no competitius, de la fracció soluble de l'anticòs recombinant. Finalment, en el cas dels anticossos per a hexaconazol i imazalil, s'ha aplicat un protocol d'enriquiment cíclic denominat panning, basat en la tecnologia de presentació de molècules proteiques en la superfície de fags (phage display). D'aquesta manera s'han obtingut anticossos recombinants a partir de cada hibridoma productor d'anticossos monoclonals. Cada anticòs recombinant s'ha expressat tant en la seva forma de proteïna lliure (scFv) com en forma de proteïna de fusió (scFv-pIII). 

De la mateixa manera, s'han emprat tècniques de biologia molecular per a la generació de biblioteques de fragments recombinants scFv a partir del material genètic de limfòcits de ratolins immunitzats per a cadascun dels tres fungicidas. En aquest cas, s'han optimitzat les condicions tant de l'etapa de construcció de biblioteques com del posterior procés d'enriquiment per panning. D'aquesta manera, s'ha obtingut un anticòs recombinant d’alta afinitat per a tetraconazol que s'ha expressat tant en la seva forma de proteïna lliure (scFv) com en forma de proteïna de fusió (scFv-pIII).

Seguidament, s'han comparat les característiques analítiques dels immunoassajos de tetraconazol, hexaconazol i imazalil, basats en anticossos monoclonals i en anticossos recombinants, tant scFv com scFv-pIII. En tots els casos, els immunoassajos basats en anticossos monoclonals han resultat més sensibles que els immunoassajos basats en anticossos recombinants. En termes d'especificitat, tots els anticossos recombinants han mostrat un patró de reconeixement comparable al de l'anticòs monoclonal corresponent.

Finalment, s'han desenvolupat ELISAs basats tant en anticossos monoclonals com en anticossos recombinantes per a la determinació de tetraconazol, hexaconazol i imazalil en mostres de sucs de fruita. Tots els immunoassajos desenvolupats han permès la determinació ràpida i senzilla del corresponent fungicida amb precisió i exactitud acceptables