Capturing RNA-Binding Proteins in Neuroblastoma Cell Lines

Abstract

[ES] El neuroblastoma representa el tumor sólido extracraneal más común en la infancia, que surge de los elementos de la cresta neural en el sistema nervioso simpático en desarrollo. La mayoría de los neuroblastomas malignos portan amplificación del gen MYCN, que codifica el factor de transcripción N-MYC, un factor central oncogénico asociado con la regulación positiva del crecimiento tumoral en neuroblastoma. Inhibidores que actúan sobre proteínas conteniendo el bromodominio BET han sido identificados como represores transcripcionales de MYCN, como iBET y JQ1, pudiendo suprimir la progresión del cáncer. Sin embargo, se sabe que varios tipos de cáncer responden de manera espectacular a estos inhibidores BET donde no se identificaron marcadores genéticos. Como resultado, encontrar biomarcadores proteínicos en lugar de genéticos representaría un avance importante en el estudio del neuroblastoma. En este trabajo, se capturó el proteoma de unión a ARN (o interactoma de ARN) de dos líneas celulares de neuroblastoma, SH-SY5Y, una línea celular de tipo wildtype sin amplificación del gen MYCN y BE(2)- C, presentando amplificación de MYCN, en ambos casos apoyándonos en la química click. Esta estrategia se basa en la incorporación del nucleósido no natural 5-etiniluridina (5EU) en el ARN naciente y el empleo de la química click para capturar las proteínas de unión al ARN. Éstas se analizaron mediante un análisis de espectrometría de masas (MS) pudiendo identificarse un total de 504 proteínas de unión al ARN estrechamente relacionados con el desarrollo y la progresión de la tumorigénesis en el neuroblastoma. Posteriormente, ambas líneas celulares se trataron con JQ1 con el fin de estudiar los cambios en la expresión génica de las proteínas de unión al ARN antes y después del tratamiento, obteniéndose las principales rutas celulares que son reguladas por JQ1 en ambas líneas celulares. Como resultado, después del tratamiento con JQ1, se obtuvo una disminución de la capacidad de proliferación celular tanto en las células MYCN-wildtype como en aquellas con amplificación del gen MYCN siendo JQ1 más eficaz en ésta última línea celular (BE (2)- C). Asu vez, se logró capturar 8 proteínas de unión al ARN que se encontraban sobre-expresadas en ambas líneas celulares bajo el tratamiento con JQ1: RPS5, HNRPDL, RPLP0, EEF1A2, RBMX, SARNP, RPL31, FARSB. Donde tres de ellas fueron identificadas previamente por Wang et al. (2018) como proteínas estrechamente relacionadas con el cáncer, dejando 5 proteínas para una posterior investigación como posibles nuevos candidatos de biomarcadores pronósticos: RPL31 (proteína ribosomal L31), HNRPDL (ribonucleoproteína nuclear heterogénea tipo D), FARSB (fenilalanil-ARNt sintetasa), SARNP (dominio SAP que contiene ribonucleoproteína) y RBMX (proteína de motivo de unión de ARN).

[EN] Neuroblastoma represents the most common extracranial solid tumor in childhood, arising from neural crest elements in the developing sympathetic nervous system. Most malignant neuroblastomas carry an amplification of the MYCN gene, encoding the transcription factor NMYC, a central oncogenic driver in neuroblastoma associated with upregulation of tumor growth. BET bromodomain inhibitors have been identified as transcriptional repressors of MYCN, such as i-BET and JQ1, being able to suppress cancer progression. Nevertheless, several cancers are known to respond dramatically to BET bromodomain inhibitors where genetic markers were not identified. As a result, searching for protein biomarkers rather than genetic ones seems to be a valuable approach. In this work the RNA-binding proteome (or RNA interactome) of two neuroblastoma cell lines, SH-SY5Y, a MYCN-wildtype cell line and BE(2)-C bearing a MYCN amplification, was captured using click chemistry. This strategy is based on incorporating the unnatural nucleoside 5-ethynyluridine (5EU) by metabolic labeling of nascent RNA and click chemistry for capturing the RNA-binding proteins. RNA interactomes were analyzed by Mass spectrometry (MS) analysis identifying a total of 504 RNA-binding proteins closely related with development and progression of tumorigenesis in neuroblastoma. Gene expression changes of RNA-binding proteins after JQ1 treatment were studied obtaining the principal up- and downregulated pathways by JQ1 in both neuroblastoma cell lines. Sustainably decreased capacity of cell proliferation was obtained in both MYCN-wildtype and MYCN-amplified neuroblastoma cells after treating with JQ1, being more effective in BE(2)-C cell line. It was possible to enrich for 8 common RNA-binding proteins exerted when both cell lines were treated: RPS5, HNRPDL, RPLP0, EEF1A2, RBMX, SARNP, RPL31, FARSB. Where three of them were previously identified as cancer-related RNA-binding proteins by Wang et al. (2018), leaving 5 for further investigation as potential new candidates for prognostic biomarkers: RPL31 (Ribosomal protein L31), HNRPDL (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like), FARSB (phenylalanyl-tRNA synthetase), SARNP (SAP domain containing ribonucleoprotein) and RBMX (RNA binding motif protein).