Estudio sobre los reguladores del canal de potasio KAT1

Abstract

[ES] La regulación de la concentración de iones en el interior celular es vital para el correcto mantenimiento y funcionamiento de todos los seres vivos, pero sobre todo de aquellos como las plantas, debido a su carácter sésil. Dicha regulación cobra aún mayor importancia cuando la planta en cuestión se encuentra en una situación de estrés salino, en la que la capacidad de regular la entrada y salida de iones a sus células será clave para su supervivencia. Los canales o bombas de iones toman un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis iónica intracelular, ya que estos regulan el transporte de iones específicos desde el medio extracelular al intracelular y viceversa, regulando así su concentración final en el citosol. Entre la gran diversidad de canales se encuentra KAT1, el cual es un canal del tipo rectificador de entrada que regulará la entrada de los iones de potasio al interior celular de las plantas. El potasio es el catión más importante en las células vegetales ya que tiene un papel clave en diversos procedimientos celulares como la síntesis proteica, actividad enzimática, regulación de la entrada de agua etc. Además, al regular la entrada de potasio en las células guarda estomáticas, KAT1 ayudará a controlar los fenómenos de apertura y cierre de las mismas, los cuales serán importantes en el intercambio de gases de la planta, evitar la entrada de parásitos etc. Pese a que se conoce mucho del funcionamiento de KAT1 como canal de iones, aún queda mucho por descubrir sobre sus mecanismos de regulación y actividad a nivel molecular. Por ello, el estudio del funcionamiento de KAT1 a nivel molecular dará información relevante que podrá ser utilizada para generar plantas más resistentes a condiciones adversas. El estudio de la regulación de la actividad de los canales de iones mediante su interacción con otras proteínas será un objetivo importante, ya que esta interacción podrá modular su actividad transportadora de iones (activándola o reprimiéndola) y por ello será tan importante como los canales en sí en el mantenimiento de la homeostasis iónica celular. En este trabajo nos centraremos en el estudio de dos posibles reguladores del canal KAT1, realizando en primer lugar un estudio de la localización subcelular de los diferentes reguladores. Estos candidatos fueron identificados previamente en nuestro laboratorio usando el sistema de identificación de interacciones proteína-proteína llamado Split-ubiquitina llevado a cabo en levadura usando una librería de ADN complementario de Arabidopsis thaliana. Posteriormente se realizará un ensayo de interacción entre proteínas en planta denominado “Biomolecular fluorescence complementation assay” o BiFC el cual consistirá en la adición de diferentes fragmentos de una proteína fluorescente a cada proteína de interés (KAT1 y posible regulador), causando que la fluorescencia sea reconstituida en el caso de que la interacción KAT1-regulador se lleve a cabo. De esta forma, mediante la observación de la fluorescencia en microscopio confocal, seremos capaces de confirmar la interacción en planta y también de observar la localización subcelular del complejo formado, lo cual podría dar información adicional sobre el mecanismo de regulación de la actividad de KAT1.

[EN] The regulation of the concentration of the different ions in cells is key for the proper maintenance and functioning of all living beings, especially those which are sessile like plants. This regulation gains even more importance when plants are exposed to salt stress, where the magnitude of the regulation of the entrance and exit of the different ions is vital for plant survival. Ion channels or pumps are the main effectors in the maintenance of intracellular ion homeostasis since they regulate the interchange of specific ions from the extracellular to intracellular medium and vice versa, thus regulating their final concentration in the cytosol. One of the key ion channels in plants is KAT1. KAT1 belongs to inward-rectifying channel family and it regulates the entrance of potassium into plant cells. Potassium is the most important cation in plant cells since it is key in many different cellular processes like protein synthesis, enzymatic activity, water influx regulation etc. Moreover, since KAT1 will regulate the entrance of potassium into guard cells, it will also help controlling their opening and closing phenomena, which plays a significant role in gas interchange, avoiding the entrance of pathogens etc. Although our knowledge about how KAT1 works as a channel is extensive, there is still little information about how it functions at the molecular level and its regulation mechanisms. Therefore, the study of KAT1 at the molecular level will produce relevant information that could be used to produce plants more resistant to harsh environmental conditions. Studying how the activity of ion channels is regulated through the interaction with other proteins is an important objective, since this interaction will determine the magnitude of the activity of ion channels, being therefore as important as channels themselves in the maintenance of ion homeostasis. In this work, we will focus on the study of two possible KAT1 regulators, first performing a study of the subcellular localization of each of them. These candidates were identified in our laboratory employing the protein-protein identification system called Split-ubiquitin performed in yeast using a complementary DNA library from Arabidopsis thaliana. Secondly, a protein interaction assay called “Biomolecular fluorescence complementation assay” or BiFC of each candidate will be performed in plants. This assay is based on the addition of a protein fragment to each protein of interest (KAT1 and possible regulators). In this type of assay, the protein fragments are two parts of the yellow fluorescent protein (YFP). Using this approach, upon protein-protein interaction of the two proteins of interest, the two YFP fragments are brought into close proximity and will reassemble to form a functional fluorescent protein. This way, using confocal microscopy, the interaction of KAT1 with each candidate can be confirmed in plants and the subcellular localization of the complex formed can also be observed, thus providing additional information regarding how the regulation of KAT1 activity may be achieved.