Descifrando el mecanismo molecular de la adhesión leucocitaria a las células endoteliales cerebrales (CECs) mediada por el microARN-155

Abstract

La disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) ¿¿es una causa frecuente de trastornos neurológicos como la esclerosis múltiple (MS). La presencia de moduladores inflamatorios (por ejemplo, citoquinas) inducen cambios en las células endoteliales del cerebro (CECs) de la BHE que conduce a una mayor permeabilidad paracelular y mayor adhesión de leucocitos a CECs. Estos cambios están parcialmente modulados por factores epigenéticos, como microARNs (miR). Los miR son oligonucleótidos de ARN cortos no codificantes que controlan la transcripción de genes a los niveles de ARNm. Se ha demostrado previamente que el miR-155 está muy regulado positivamente en microvasos procedente de tejidos de MS con lesiones agudas y en CECs después de la inducción de inflamación in vitro. Además, la sobreexpresión de este miR en CECs aumenta la permeabilidad paracelular, apuntando a cuatro moléculas diferentes. MiR-155 también modula la adhesión de leucocitos a CECs, sin embargo, el mecanismo molecular involucrado es aún desconocido. En 2016, se demostró que desregulación de WNK1 en leucocitos aumenta su adhesión a CECs. Además, WNK1 es una diana predicha de miR-155. Por esto, se plantea la hipótesis de que la sobreexpresión de miR-155 conduce a niveles reducidos de WNK1, lo que resulta en un aumento de la adhesión de leucocitos a CECs. Para la validación de esta hipótesis se plantean tres objetivos: estudiar si la transfección con ARNip de WNK1 aumenta la adhesión de leucocitos y analizar si la transfección con pre-miR-155 o la estimulación con citoquinas disminuyen los niveles de WNK1 en células hCMEC/D3. Para ello, hemos llevado a cabo ensayos de transfección, RT-qPCR, Citometría de flujo, Western Blot, ensayo de adhesión, Inmunocitoquímica, así como técnicas de cultivo celular.

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a common cause of neurological disorders such as Multiple Sclerosis (MS). The presence of inflammatory modulators (e.g. cytokines) induce changes on the brain endothelial cells (BECs) of the BBB that leads to increased paracellular permeability and leukocyte adhesion to BECs. These changes are partially modulated by epigenetic factors such as microRNAs (miR). MiR are short non-coding RNA oligonucleotides that control gene transcription at the mRNA levels. It has previously demonstrated that miR-155 is highly upregulated in microvessels from MS tissue with acute lesions and in BECs after an inflammatory challenge in vitro. Furthermore, this overexpression of this miR in BECs increases the paracellular permeability by targeting four different molecules. MiR-155 also modulates leukocyte adhesion to BECs, however, the molecular mechanism involved is still unknown. In 2016, it was demonstrated that downregulation of WNK1 in leukocytes increases their adhesion to BECs. Furthermore, WNK1 is a predicted target of miR-155. Therefore, we hypothesize that overexpression of miR-155 leads to decreased levels of WNK1 resulting in increased leukocyte adhesion to BECs. The aims of this research project are to study whether transfection with WNK1 siRNA increases the adhesion of leukocytes and to analyze whether transfection with pre-miR-155 or stimulation with cytokines reduces WNK1 levels in hCMEC / D3 cells. For this, we carried out transfection assays, RT-qPCR, flow cytometry, Western Blot, adhesion assay, immunocytochemistry, as well as cell culture techniques.