Identificación de mutantes insercionales de tomate afectados en el grado de tolerancia a la salinidad

Abstract

La producción de tomate, una de las especies hortícolas más importantes a nivel mundial, se concentra en zonas que adolecen, o pueden adolecer en el futuro, de una excesiva concentración salina o de problemas relacionados con la salinización secundaria o, alternativamente, en regiones que sufren de periodos cíclicos de sequía, lo que provoca una carencia de agua para el riego. Aunque los estreses salino e hídrico están causados por factores ambientales distintos (altas concentraciones de sal, en un caso, y escasa disponibilidad de agua, en el otro) comparten algunos mecanismos comunes. En situaciones de déficit hídrico la planta necesita ajustarse osmóticamente para poder seguir absorbiendo agua. De forma similar, el primer problema ocasionado por la salinidad es también un efecto osmótico, ya que la disminución del potencial osmótico del medio dificulta la absorción de agua y nutrientes por la raíz, lo que equivale al efecto provocado por el estrés hídrico en la planta. Estos dos tipos de estrés limitan considerablemente la productividad y, desde el punto de vista económico, provocan pérdidas notables. Ante la dimensión de estos problemas, es evidente que hay que dar algún tipo de respuesta y, si nos ceñimos al terreno de la mejora genética, ésta pasa por el desarrollo de cultivares con mayor tolerancia al estrés salino y/o hídrico. Se trata de caracteres complejos y, por ello, los resultados obtenidos en este apartado de la mejora han sido escasos. Sin embargo, en el momento presente los métodos clásicos de mejora se han visto enriquecidos con técnicas de corte biotecnológico que, en algunos casos, pueden ayudar a superar este tipo de problemas. El descubrimiento de nuevos genes y la determinación tanto de sus patrones de expresión como de sus funciones específicas en condiciones de estrés podrían proporcionar las bases para la obtención de plantas con mayor nivel de tolerancia a la sequía y salinidad. Desde un punto de vista metodológico, el análisis genético y molecular de mutantes hipersensibles al estrés constituye una de las vías más exitosas para identificar los determinantes de la tolerancia. En este sentido, la mutagénesis insercional con T-DNA se ha convertido en una de las herramientas más prometedoras para la identificación de genes y el análisis de su función. Otra aplicación de la mutagénesis insercional por T-DNA estriba en la detección de elementos de regulación mediante el empleo de los denominados "sistemas trampa" (trapping), que permiten detectar secuencias reguladoras y asignar una función a partir de datos de expresión génica. El interés de la mutagénesis insercional mediante trampas génicas reside en la naturaleza dual de dichas trampas, ya que por un lado, permiten identificar los elementos de regulación de un gen, y llevar a cabo el análisis funcional, y por otro generan mutaciones de inserción de T-DNA. En ambos casos, el gen queda etiquetado por el T-DNA, facilitando la clonación del mismo. En nuestro laboratorio estamos empleando estas dos herramientas genómicas, mutagénesis insercional y trapping, en tomate para identificar secuencias codificantes o elementos de regulación de genes implicados en la tolerancia o susceptibilidad a estos dos tipos de estrés abiótico. Para ello, estamos utilizando el vector pD991 (cedido amablemente por el Dr. Tomas Jack; Department of Biological Sciences; Dartmouth College, USA) que contiene un promotor mínimo (caja TATA + inicio de transcripción) al que se encuentra fusionada la región estructural del gen uidA. El promotor mínimo no es capaz de promover un nivel de transcripción detectable, pero su inserción en el área de actuación de un determinado intensificador debería activar la expresión del delator, mimetizando el patrón de expresión que dicho intensificador confiere al gen endógeno. En este contexto, los trabajos realizados en años pretéritos han conducido a la obtención de más de 1000 líneas transgénicas de tomate Moneymaker con el vector pD991. El principal objetivo se este trabajo ha sido la identificación de mutantes de inserción afectados en el grado de tolerancia a la salinidad a partir de la colección de líneas T-DNA con el vector pD991. Previamente, se establecieron las condiciones más adecuadas para llevar a cabo las evaluaciones en condiciones de cultivo in vitro. Por lo que respecta a los resultados, se han evaluado 155 líneas transgénicas y se han identificado algunas líneas transgénicas afectadas en el grado de tolerancia a la salinidad. La caracterización genética de las líneas más interesantes indicó que los mutantes identificados eran de naturaleza recesiva y exhibían un patrón de segregación simple mendeliano.