Therapeutic approaches and development of genomic diagnostic tools for Usher syndrome

Abstract

[ES] El síndrome de Usher (USH) es un trastorno raro autosómico recesivo definido principalmente por sordera neurosensorial (SNHL), y una distrofia retiniana conocida como retinosis pigmentaria (RP). La patología muestra heterogeneidad genética, puesto que se conocen al menos 10 genes responsables. No obstante, las mutaciones en USH2A son la causa más frecuente de la enfermedad, en gran medida por la recurrencia de la variante patogénica c.2299delG. En esta tesis se ha desarrollado un ensayo de edición génica para revertir dicha anomalía genética por medio del sistema CRISPR/Cas9. Se diseñaron y probaron varios complejos CRISPR específicos de locus, y el más eficiente fue usado para la corrección de la mutación c.2299delG en células derivadas de pacientes. La tasa de corrección de la mutación obtenida fue del 2.5%. Otro objetivo de esta tesis ha sido la caracterización genética de pacientes USH aún sin diagnóstico molecular. Una primera fase implicó la secuenciación masiva dirigida de las regiones codificantes de todos los genes asociados a la enfermedad. Este estudio, cuya cohorte incluyó 58 pacientes no escrutados previamente, permitió la identificación de 42 nuevas mutaciones presuntamente patológicas, y una tasa general de detección de alelos responsables de la enfermedad de prácticamente el 83%. Sorprendentemente, uno de los sujetos presentaba mutaciones en CEP250, uno de los últimos genes correlacionados con la enfermedad. Una exhaustiva revisión clínica reveló que la degeneración retiniana se trataba en realidad de una distrofia de conos y bastones en lugar de RP clásica, lo cual permitió consolidación del gen CEP250 como responsable de un fenotipo similar al USH. El resto de casos sin resolver induce a sospechar de la existencia de otros genes vinculados con USH. Así pues, se analizó el exoma íntegro de dichos casos negativos del panel por medio de secuenciación de exoma completo, lo cual proporcionó resultados relevantes en seis de las muestras estudiadas. Uno de tales sujetos resultó ser un claro caso de fenocopia de USH, al albergar mutaciones patogénicas en dos genes independientes, TECTA y REEP6, siendo el primero responsable de la SNHL y el segundo de la RP. De forma parecida, en otro paciente se detectaron variantes patológicas para RP en el gen EYS, pero no se identificó paralelamente ningún cambio genético que explicara la SNHL. Tres individuos adicionales resultaron haber sido erróneamente diagnosticados como USH, dada la conclusiva inexistencia o ambigüedad de la sordera. Uno de ellos fue definido como homocigoto de una mutación en CNGB1, ya reconocido como responsable de RP. En el segundo de dichos sujetos se identificó una mutación en homocigosis en el gen GRN, cuyos defectos en estado heterocigoto están asociados a demencia frontotemporal y más raramente combinada con RP si ambos alelos se encuentran alterados. Por otro lado, el tercer paciente fue resuelto como heterocigoto compuesto de variantes en WDR19, un gen asociado en mayor medida a una distrofia retiniana acompañada de trastornos renales y, más raramente, a la forma aislada del síntoma. En el último de los seis casos resaltados de este objetivo se detectó una mutación homocigota sin sentido en el gen ASIC5, cuyo papel en el organismo todavía se desconoce. Sin embargo, se han correlacionado funciones visuales y auditivas para miembros de la misma familia proteica. En conjunto, los hallazgos obtenidos en este trabajo avalan la importancia del uso de las más novedosas tecnologías en la búsqueda de soluciones para enfermedades raras, las cuales presentan por ahora un pronóstico terapéutico bastante desamparado. Asimismo, otras consecuencias positivas en cuanto a la caracterización genética de los pacientes son la corroboración (o rectificación) del diagnóstico inicial, así como la contribución a la estimación demográfica y correlaciones de genotipo-fenotipo, que en definit

[CA] La síndrome d'Usher (USH) és una malaltia rara autosòmic recessiu definit principalment per sordera neurosensorial (SNHL) i una distròfia retiniana coneguda com a retinosi pigmentària (RP). La patologia mostra heterogeneïtat genètica, ja que es coneixen almenys 10 gens responsables. No obstant això, les mutacions en USH2A són la causa més freqüent de la malaltia, a causa de la recurrència de la variant patogènica c.2299delG. En aquesta tesi s'ha desenvolupat un assaig d'edició gènica per a revertir la dita anomalia genètica per mitjà del sistema CRISPR/Cas9. Es van dissenyar i van probar diversos complexos CRISPR específics de locus, i el més eficient va ser usat per a la correcció de la mutació en cèl·lules derivades de pacients. La taxa de correcció de la mutació obtinguda va ser del 2.5%. Un altre objectiu d'aquesta tesi ha sigut la caracterització genètica de pacients USH encara sense diagnòstic molecular. Una primera fase va implicar la seqüenciació massiva dirigida de les regions codificants de tots els gens associats a la malaltia. Aquest estudi, la cohort de la qual va incloure 58 pacients no escrutats prèviament, va permetre la identificació de 42 noves mutacions presumptament patològiques, i una taxa general de detecció d'al·lels responsables de la malaltia de pràcticament el 83%. Sorprenentment, un dels subjectes presentava mutacions en CEP250, un dels últims gens correlacionats amb la malaltia. Una exhaustiva revisió clínica va revelar que la degeneració retiniana es tractava en realitat d'una distròfia de cons i bastons en lloc de RP clàssica. Aquestes troballes han permés la consolidació del gen CEP250 com a responsable d'un fenotip similar al USH. La resta de casos sense resoldre induïx a sospitar de l'existència d'altres gens vinculats amb USH. Així, doncs, es va analitzar l'exoma íntegre dels casos negatius del panell a través de seqüenciació d'exoma complet, cosa que va proporcionar resultats rellevants en sis de les mostres estudiades. Un de tals subjectes va resultar ser un clar cas de fenocopia d'USH, a l'albergar mutacions patogèniques en dos gens independents, TECTA i REEP6, sent el primer responsable de la SNHL i el segon de la RP. De forma semblant, en un altre pacient es van detectar variants patològiques per a RP al gen EYS, però no es va identificar paral·lelament cap canvi genètic que explicara la SNHL. Tres individus addicionals van resultar haver sigut erròniament diagnosticats com USH, donada la final inexistència o ambigüitat de la sordera. Un d'ells va ser definit com a homozigot d'una mutació en CNGB1, ja reconegut com a responsable de RP. En el segon d'aquestes subjectes es va identificar una mutació en homozigosi en el gen GRN, els defectes del qual estan associats a demència frontotemporal en estat heterozigot, i més rarament en combinació amb RP si ambdós al·lels es troben alterats. D'altra banda, el tercer pacient va ser resolt com a heterozigot compost de variants en WDR19, un gen associat en major grau a una distròfia retiniana acompanyada de trastorns renals i, més rarament, a la forma aïllada del símptoma. En l'últim dels sis casos ressaltats d'aquest objectiu es va detectar una mutació homozigota sense sentit en el gen ASIC5, el paper en l'organisme del qual encara es desconeix. Amb tot, s'han correlacionat funcions visuals i auditives per a membres de la mateixa família proteica. En conjunt, les troballes obtingudes en aquest treball avalen la importància de l'ús de les més noves tecnologies en la recerca de solucions per a malalties rares, les quals presenten per ara un pronòstic terapèutic prou desemparat. Així mateix, altres conseqüències positives quant a la caracterització genètica dels pacients són la corroboració (o rectificació) del diagnòstic inicial, així com la contribució a l'estimació demogràfica i correlacions de genotip-fenotip, que en definitiva ajuden en la compressió d'US

[EN] Usher syndrome (USH) is a rare autosomal recessive disorder defined essentially by sensorineural hearing loss (SNHL) and a retinal dystrophy known as retinitis pigmentosa (RP). The condition shows a genetic heterogeneity, since there are at least 10 genes known to be causative of the syndrome. However, mutations in USH2A are the most frequent cause of the disease, due in a large measure to the recurrence of the c.2299delG pathogenic variant. A gene editing assay to reverse this specific genetic anomaly was developed in this thesis by means of the groundbreaking CRISPR/Cas9 system. Several locus-specific CRISPR complexes were designed and tested, and the most efficient was used to proceed with the c.2299delG mutation correction on patient-derived cells. The trial resulted in a mutation correction rate of 2.5%. Another goal of this thesis was the genetic characterization of molecularly undiagnosed USH patients. Given the genetic diversity of the disease, the procedure required the implementation of high-throughput sequencing, a technology that enables in bulk sequencing of any number of selected loci (or the indiscriminate totality) of the genome. The first phase implied the targeted sequencing of the coding-relevant regions of all known causative or disease-associated genes at the moment. The study, comprising a cohort of 58 previously unscreened patients, enabled the identification of 42 novel putative pathogenic mutations, and an etiologic-allele detection ratio shy of 83%. Remarkably, one of the subjects harbored nonsense mutations in CEP250, which is one of the latest USH-associated genes. However, an exhaustive review of the clinical features unmasked the retinal degeneration as a cone-rod dystrophy rather than RP, which reinforced the linkage of the gene to an USH-like phenotype. The remaining portion of unresolved cases lead to suspicion of the existence of other genes accountable for USH. Hence, the complete exome of such panel-negative cases was screened through whole exome sequencing. This venture provided relevant findings in six of the surveyed samples. One subject was plainly exposed as an USH phenocopy by harboring pathogenic splice-site mutations in two independent genes, TECTA and REEP6, the former responsible for the SNHL and the latter for the RP. Similarly, RP-causative variants in EYS were detected in another patient, yet no pathogenic changes explaining the HL were discovered. Three additional individuals were ultimately unveiled as USH misdiagnosed cases, being the HL actually absent or ambiguous. One of the patients in this set was homozygous for a mutation in CNGB1, already known to be accountable for RP. The other two cases showed a more peculiar outcome being compound heterozygous for putatively pathogenic variants in genes generally associated to other disorders. One presented a homozygous mutation in GRN, a gene associated to frontotemporal dementia under heterozygous condition and less commonly to combined RP for homozygous alterations. The third subject was found to be a carrier of mutations in WDR19, a gene best associated with retinal disorders accompanied by renal signs and rarely with the isolated visual symptom. The last case presented a homozygous nonsense variant in the ASIC5 gene, whose role has yet to be learned. However, some correlations to visual and hearing functions have been reported for members of the same protein family. Altogether, the results obtained from this work attest to the importance of applying the most up-to-date technologies in the search of solutions for rare diseases that realistically pose a despairing therapeutic prognosis. In addition, the positive consequences of the genetic characterization of the patients are the corroboration (or else correction) of the initial diagnosis, and the contribution to the appraisal of demographic and genotype-phenotype correlations, which ultimately aid in the understanding USH and other related diseases.