Caracterización del sistema GCN en plantas mediante la utilización de mutantes de pérdida de función

Abstract

[ES] La proteína quinasa GCN2 es una proteína conservada en todos los eucariotas implicada en el control de la traducción en condiciones de estrés. Está considerada un punto clave en el control de la homeostasis celular y un sensor de distintas condiciones de estrés. El estrés que inició su caracterización en levaduras y células animales es el ayuno de aminoácidos, pero recientemente se ha observado activación de este sistema ante multitud de estreses tanto bióticos como abióticos. El sistema GCN se ha descrito ampliamente en Saccharomyces cerevisiae: GCN2 se une a las proteínas GCN1 y GCN20, permitiendo la activación de la quinasa en situaciones de ayuno de aminoácidos. GCN2 se activa por tRNA no cargados, y posteriormente fosforila al factor de traducción eIF2¿, lo que conlleva una reducción de la síntesis global de proteínas, pero también una mayor traducción de mRNA específicos, como los que codifican a GCN4. Este factor de transcripción regulará la expresión de nuevos genes, lo que permite que la célula pueda iniciar una respuesta de adaptación al estrés. En plantas se desconoce con detalle como el sistema GCN contribuye a mitigar el estrés y controlar la homeostasis. Las tres proteínas conocidas de este sistema tienen homólogos en Arabidopsis. Diversos estudios indican que el mecanismo de actuación de GCN2 en plantas presenta muchas incógnitas. Mientras que la quinasa GCN2 de plantas se activa bajo diferentes situaciones de estrés, la participación de los homólogos de GCN1 y GCN20 en estos procesos es controvertida, y recientemente se ha propuesto un nuevo papel para GCN1 en la traducción, independiente de GCN2. El homólogo de GCN1 en plantas está implicado en la inmunidad innata y adquirida y sus líneas mutantes presentan fenotipos muy diferentes a los de las líneas mutantes en GCN2. La relación funcional entre estos dos genes sigue siendo difícil de definir en plantas. En esta tesis, demostramos que, aunque los genes GCN1 y GCN2 de Arabidopsis son necesarios para mediar la fosforilación de eIF2¿ tras tratamientos con glifosato, inhibidor de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, los mutantes de pérdida de función de ambas líneas desarrollan distintos fenotipos de raíz y cloroplasto. Los experimentos de microscopía electrónica revelan que los mutantes en GCN1, pero no en GCN2, se ven afectados en la biogénesis de cloroplastos, lo que explica el fenotipo macroscópico observado previamente para estos mutantes. Los mutantes en GCN1 presentan una compleja reprogramación transcripcional que afecta, entre otros, a las respuestas relacionadas con los mecanismos de defensa, fotosíntesis y al correcto plegamiento de las proteínas. Por otro lado, mostramos que ninguno de los cinco genes homólogos a GCN20 en Arabidopsis en necesario para la fosforilación de eIF2¿. Además, los fenotipos bajo estrés abiótico de plantas mutantes en los mismos, y el desarrollo de sus cloroplastos, sugiere que GCN20 está funcionalmente relacionado con GCN1, pero no con GCN2, algo que se confirma ya que los mutantes gcn1 y gcn20 comparten una reprogramación transcripcional similar, afectando a la fotosíntesis y a las respuestas frente al estrés. Identificamos la proteína quinasa GCN2 como un componente celular que fomenta la acción del glifosato en Arabidopsis. Los estudios comparativos que utilizan plántulas mutantes de pérdida de función de GCN2 muestran que el programa molecular que la planta despliega después del tratamiento con el herbicida no está teniendo lugar. Además, las plantas adultas gcn2 muestran una menor inhibición de la fotosíntesis, y acumulan menos ácido siquímico que las de tipo silvestre después del tratamiento con glifosato. Algo similar ocurre tras el tratamiento con luz ultravioleta UV-B, donde mutantes de pérdida de función son más resistentes. La activación de GCN2 ante este estrés es independiente del fotorreceptor UV-B (UVR8) y de sus componentes de señalización aguas abajo y de la vía de señalización de estrés de las MAP quinasas.

[EN] The GCN2 protein kinase is a conserved protein in all eukaryotes involved in translation control under stress conditions. It is considered a key point in the control of cellular homeostasis and a sensor for a wide variety of stress conditions. Aminoacid fasting was the stress that started its characterization in yeast and animal, but recently activation of this system has been observed in both biotic and abiotic stresses. The GCN system has been extensively described in Saccharomyces cerevisiae: GCN2 binds to GCN1 and GCN20 proteins, allowing kinase activation in aminoacid fasting situations. GCN2 is activated by uncharged tRNAs, and subsequently phosphorylates the translation factor eIF2¿, leading to a reduction in overall protein synthesis, but also a greater translation of specific mRNAs, such as those encoding GCN4. This transcription factor will regulate the expression of new genes, allowing the cell to initiate an adaptive response to stress. In plants, it is not deeply known how the GCN system helps to alleviate stress and control homeostasis. All three known proteins in this system have homologs in Arabidopsis. Some studies indicate that the mechanism of action of GCN2 in plants presents many gaps. While plant GCN2 kinase is activated under different stress situations, the involvement of GCN1 and GCN20 homologs in these processes is controversial, and recently it has been proposed a new role for GCN1 in translation, independent from GCN2. The GCN1 homolog in plants is involved in innate and acquired immunity and its mutant lines present very different phenotypes from those of the GCN2 mutant lines. The functional relationship between these two genes is difficult to define in plants. In this thesis, we prove that, although the Arabidopsis GCN1 and GCN2 genes are necessary to mediate in the phosphorylation of eIF2¿ after treatments with glyphosate, an inhibitor of aromatic aminoacid biosynthesis, the loss of function mutants of both lines develop different phenotypes of root and chloroplast. Electron microscopy experiments reveal that the mutants in GCN1, but not in GCN2, are affected in chloroplast biogenesis, which explains the macroscopic phenotype previously observed for these mutants. The mutants in GCN1 present a complex transcriptional reprogramming that affects, among others, the responses related to defense mechanisms, photosynthesis and the correct folding of proteins. On the other hand, we show that none of the five GCN20 homologous genes in Arabidopsis is necessary for the phosphorylation of eIF2¿. Furthermore, the phenotypes under abiotic stress of mutant plants in them, and the development of their chloroplasts, suggest that GCN20 is functionally related to GCN1, but not to GCN2, which is confirmed because the gcn1 and gcn20 mutants share a similar transcriptional reprogramming and affects photosynthesis and stress responses. We identify the GCN2 protein kinase as a cellular component that promotes the action of glyphosate in Arabidopsis. Comparative studies using GCN2 loss-of-function mutant seedlings show that the molecular program that the plant develops after the treatment with the herbicide is not taking place. Furthermore, adult gcn2 plants show less inhibition of photosynthesis, and accumulate less shikimic acid than wild-type ones after glyphosate treatment. Something similar happens after treatment with UV-B ultraviolet light, where loss-of-function mutants are more resistant. Activation of GCN2 in the face of this stress is independent of the UV-B photoreceptor and its downstream signaling components and the stress signaling pathway of MAP kinases.

[CA] La proteína quinasa GCN2 és una proteïna conservada en tots els organismes eucariotes implicada en el control de la traducció en condicions d'estrés. Està considerada un punt clau en el control de l'homeòstasis cel.lular i es un sensor de diferents i variades condicions d'estrés. L' estrés que va iniciar la seua caracterització en llevats i cèl.lules animals és el dejuni d' aminoàcids, però recentment s'ha observat l'activació d'aquest sistema davant de multitud d'estressos tant biòtics com abiòtics. El sistema GCN ha segut descrit ampliament en Saccharomyces cerevisiae: GCN2 s'uneix a les proteïnes GCN1 y GCN20, permitint l'activació de la quinasa en situacions de dejuni d'aminoàcids. GCN2 s'activa per tRNA no carregats, i posteriorment fosforila el factor de traducció eIF2¿, donant lloc a una reducció de la síntesi global de proteïnes, però també una major traducció de mRNA específics, com els que codifiquen a GCN4. Aquest factor de transcripció regularà l'expressió de nous gens, el que permet que la cèl·lula puga iniciar una resposta d'adaptació a l'estrés. En plantes es desconeix amb detall com el sistema GCN contribueix a mitigar l'estrés i controlar l'homeòstasi. Les tres proteïnes conegudes d'aquest sistema tenen homòlegs en Arabidopsis. Diversos estudis indiquen que el mecanismo d'actuació de GCN2 en plantes presenta moltes incògnites. Mentres que la quinasa GCN2 de plantes es activada en diferents situacions d'estrés, la participació dels homòlegs de GCN1 i GCN20 en aquests processos és controvertida, i recentment s'ha proposat un nou paper per a GCN1 en la traducció, independent de GCN2. L'homòleg de GCN1 en plantes està implicat en la inmunidad innata i adquirida i les seues línies mutants presenten fenotips molt diferents als de les línies mutants en GCN2. La relació funcional entre estos dos gens continua sent difícil de definir en plantes. En esta tesi, demostrem que, encara que els gens GCN1 i GCN2 d' Arabidopsis són necessaris per a donar lloc a la fosforilació d'eIF2¿ després de ser tractada amb glifosato, inhibidor de la biosíntesi d' aminoàcids aromàtics, els mutants de pèrdua de funció d'ambes línies desenvolupen distints fenotips d'arrel i cloroplast. Els experiments de microscòpia electrònica revelen que els mutants en GCN1, però no en GCN2, es veuen afectats en la biogènesis de cloroplastos, el que explica el fenotip macroscòpic observat prèviament per a estos mutants. Els mutants en GCN1 presenten una complexa reprogramació transcripcional que afecta, entre d'altres, a les respostes relacionadaes amb els mecanismes de defensa, fotosíntesi i al correcte plegament de les proteïnes. D'altra banda, demostrem que ningun dels cinc gens homòlegs a GCN20 en Arabidopsis és necessari per a la fosforilació d' eIF2¿. Ademés, els fenotips baix estrés abiòtic de plantes mutants en ells mateix, i el desenvolupament dels seus cloroplasts, sugereixen que GCN20 està funcionalment relacionat amb GCN1, però no amb GCN2, cosa que es confirma ja que els mutants gcn1 i gcn20 compartixen una reprogramació transcripcional similar, afectant a la fotosíntesi i les respostes davant l'estrés. Identifiquem la proteïna quinasa GCN2 com un component cel.lular que fomenta l'acció del glifosato en Arabidopsis. Els estudis comparatius que utilitzen plántules mutants de pèrdua de funció de GCN2 mostren que el programa mol.lecular que la planta desplega després del tractament amb herbicida no está ocorreguent. Ademés, les plantes adultes gcn2 presenten una menor inhibició de la fotosíntesi, i acumulen menys àcid siquímic que les de tipus silvestre després de ser tractades amb glifosato. S'obté un resultat semblant després del tractament amb llum ultravioleta UV-B, on els mutants de pèrdua funció són més resistents. La activación de GCN2 ante este estrés es independiente del fotorreceptor UV-B (UVR8) y de sus componentes de señalización aguas abajo y de la vía de señalización de estrés de las MAP quinasas.