Estudi del fenòmen d'exclusió entre vectors vírics homòlegs i la seua aplicació per a l'expressió de proteïnes recombinants en planta

Abstract

Actualment, l'expressió transitòria amb vectors vírics és la tècnica més eficient utilitzada en molecular pharming. Una de les limitacions que afecten l'ús de vectors vírics és l'existència d'un fenomen d'exclusió entre virions homòlegs que impedeix la seua coexpressió sincrònica en una mateixa cèl·lula. Aquest fenomen no permet que es puguen expresar proteïnes oligomèriques mijançant la simple coinfecció de diferents clons del mateix vector víric. En canvi, l'exclusió virica pot resultar una estratègia interessant per produir una mescla policlonal de proteïnes segregades i que no competeixen entre si, el que tindria una aplicació pràctica, per exemple, en la producció d'anticossos policlonals. Aquesta memòria experimental posa a prova el sistema de provectors magnICON tractant de reproduir el fenomen d'exclusió homòloga entre amplicons vírics i estudiant les seues implicacions. Utilitzant aquests vectors per expressar proteïnes fluorescents reporteres sobre fulles de Nicotiana benthamiana s'ha observat un patró d'exclusió a mode de mosaic policlonal en el qual els amplicons vírics s'exclouen segregant-se espacialment entre les 3 i 4h PI. Els resultats obtinguts in vivo també han servit per comprovar la validesa d'un primordi de software que permetria simular el patró d'exclusió derivat d'una mescla policlonal determinada. Entre les aplicacions alternatives del fenomen, hi ha la possibilitat de combinar l'exclusió virica and una expressio recombinant subjacent no excloent, per exemple, per fer screenings in vivo superposant el mosaic policlonal a un fons recombinant que s'expresse en tot el teixit. Amb aquesta premisa al cap, es va assatjar la compatibilitat entre els amplicons vírics excloents i una col·lecció de T-DNAs en vectors binaris clàssics, obtenint-se resultats positius de coexpressió sincrònica. Tot i així, es va observar que els nivells d'expressió són força dispars entre tots dos vectors, el que podria perjudicar el seu ús conjunt. En conseqüència, es va plantejar l'ús de T-DNAs millorats amb pro-seqüències víriques que no amplifiquen virions, i que per tant, tampoc es veien afectats pel fenomen d'exclusió. Aquests nous vectors (pEAQ) asseguren majors nivells d'expressió de proteïnes recombinants, més acord amb la superproducció dels vectors vírics amb els quals s'han de combinar.