The abscission regulatory module INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) / HAESA (HAE)-like receptor kinases in Solanaceae species: Functional analysis in Nicotiana benthamiana

Abstract

[ES] La abscisión es un proceso de separación celular activo, organizado y altamente coordinado que permite el desprendimiento de órganos vegetativos y reproductivos completos, mediante la modificación de la adhesión celular y la desintegración de las paredes celulares en lugares específicos del cuerpo de la planta conocidos como zonas de abscisión. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), la abscisión de órganos florales y hojas caulinares está regulada por la interacción entre el péptido hormonal (IDA), un par de proteínas quinasas de tipo receptor redundantes, (HAE y HSL2), y correceptores de la familia SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE.

El conocimiento sobre la maquinaria molecular que regula la abscisión en especies de plantas de importancia económica de la familia de las solanáceas es en la actualidad escaso. En esta investigación de doctorado, se realizó un análisis funcional de los componentes del módulo de señalización de abscisión IDA-HAE en N. benthamiana. En la primera sección de este trabajo, se estudió el grado de conservación y la filogenia de las familias de genes IDA-like y HAE-like en especies relevantes del género Solanum, Capsicum y Nicotiana.

Se analizó la expresión de estos genes en el alopoliploide N. benthamiana, con el fin de identificar miembros implicados en la abscisión y en la respuesta a condiciones de estrés abiótico como la sequía. En la segunda sección, se evaluó el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de NbenIDA1A y NbenIDA1B, dos homeólogos IDA-like de N. benthamiana que se asociaron con la abscisión de la corola en la sección anterior. Además, también se determinó el efecto sobre la abscisión de la corola del silenciamiento de NbenHAE.1.

Las relaciones filogenéticas entre los miembros IDA-like de las solanáceas estudiadas, agruparon los dos pares de homeólogos de proteínas NbenIDA1 y NbenIDA2 con los prepropéptidos de Arabidopsis relacionados con la abscisión. El análisis de las regiones promotoras en busca de elementos reguladores reveló que estos dos pares de homeólogos contenían elementos de respuesta tanto hormonales como de respuesta a la sequía, aunque NbenIDA2A carecía de los elementos reguladores hormonales.

Los análisis de expresión génica también indican que el par de homeólogos NbenIDA1 se regulan positivamente durante la abscisión de la corola. Los pares NbenIDA1 y NbenIDA2 mostraron una expresión diferencial tisular en condiciones de estrés hídrico, ya que los homeólogos NbenIDA1 se indujeron en hojas estresadas, mientras que los homeólogos NbenIDA2, especialmente NbenIDA2B, se indujeron en raíces estresadas. En las plantas con crecimiento activo no estresadas, los nudos y los entrenudos fueron los tejidos con los niveles de expresión más altos de todos los miembros de la familia IDA-like y sus receptores HAE-like putativos.

El silenciamiento basado en VIGS del par de homeólogos NibenIDA1 y NbenHAE.1 suprimió la abscisión de la corola en flores de N. benthamiana, lo que fue causado por un bloqueo en la desintegración de la pared celular en la base de la corola, probablemente debido a la falta de inducción de las enzimas hidrolíticas relacionadas con la abscisión. La sobreexpresión ectópica del homeólogo NbenIDA1A adelantó la senescencia y la abscisión de la corola y afectó negativamente al crecimiento de las plantas de N. benthamiana.

Los resultados obtenidos utilizando la aproximación VIGS mostraron que el par de homeólogos NbenIDA1 y el receptor NbenHAE.1, posiblemente actuando como un módulo de señalización similar al descrito en Arabidopsis, regulan la abscisión de la corola en las flores de N. benthamiana. Este es, por tanto, el primer ejemplo en una especie vegetal distinta de Arabidopsis thaliana que indica que el módulo de señalización de abscisión IDA-HAE/HSL2 se conserva en las angiospermas.

[CA] L'abscisió és un procés de separació cel·lular actiu, organitzat i altament coordinat que permet el despreniment d'òrgans vegetatius i reproductius complets, mitjançant la modificació de l'adhesió cel·lular i la desintegració de les parets cel·lulars en llocs específics del cos de la planta coneguts com a zones d'abscisió. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), l'abscisió d'òrgans florals i fulles caulinars està regulada per la interacció entre el pèptid hormonal (IDA), un parell de proteïnes cinases de tipus receptor redundants, (HAE i HSL2), i coreceptors de la família SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE.

El coneixement sobre la maquinària molecular que regula l'abscisió en espècies de plantes d'importància econòmica de la família de les solanàcies és en l'actualitat escàs. En aquesta recerca de doctorat, es va realitzar una anàlisi funcional dels components del mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE en N. benthamiana. A la primera secció d'aquest treball, es va estudiar el grau de conservació i la filogènia de les famílies de gens IDA-like i HAE-like en espècies rellevants de l'gènere Solanum, Capsicum i Nicotiana.

Es va analitzar l'expressió d'aquests gens en l'al·lopoliploide N. benthamiana, per tal d'identificar membres implicats en l'abscisió i en la resposta a condicions d'estrès abiòtic, com la sequera. A la segona secció, es va avaluar l'efecte del silenciament i la sobreexpressió de NbenIDA1A i NbenIDA1B, dos homeòlegs IDA-like de N. benthamiana, que es van associar amb l'abscisió de la corol·la en la secció anterior. A més, també es va determinar l'efecte sobre l'abscisió de la corol·la del silenciament de NbenHAE.1.

Les relacions filogenètiques entre els membres IDA-like de les solanàcies estudiades, van agrupar els dos parells d'homeòlegs de proteïnes NbenIDA1 i NbenIDA2 amb els prepropèptids d'Arabidopsis relacionats amb l'abscisió. L'anàlisi de les regions promotores a la recerca d'elements reguladors va revelar que aquests dos parells d'homeòlegs contenien elements de resposta tant hormonals com de resposta a la sequera, encara que NbenIDA2A mancava dels elements reguladors hormonals.

Les anàlisis d'expressió gènica també indiquen que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 es regulen positivament durant l'abscisió de la corol·la. Els parells NbenIDA1 i NbenIDA2 van mostrar una expressió diferencial tissular en condicions d'estrès hídric, ja que els homeòlegs NbenIDA1 es van induir en fulls estressades, mentre que els homeòlegs NbenIDA2, especialment NbenIDA2B, es van induir en arrels estressades. A les plantes amb creixement actiu no estressades, els nusos i els entrenusos van ser els teixits amb els nivells d'expressió més alts de tots els membres de la família IDA-like i els seus receptors HAE-like putatius.

El silenciament basat en VIGS del parell d'homeòlegs NibenIDA1 i NbenHAE.1 va suprimir l'abscisió de la corol·la en flors de N. benthamiana, lo qual va ser causat per un bloqueig en la desintegració de la paret cel·lular a la base de la corol·la, probablement degut a la manca d'inducció dels enzims hidrolítics relacionades amb l'abscisió. La sobreexpressió ectòpica de l'homeòleg NbenIDA1A va avançar la senescència i l'abscisió de la corol·la i va afectar negativament el creixement de les plantes de N. benthamiana.

Els resultats obtinguts utilitzant l'aproximació VIGS van mostrar que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 i el receptor NbenHAE.1, possiblement actuant com un mòdul de senyalització similar al descrit en Arabidopsis, regulen l'abscisió de la corol·la en les flors de N. benthamiana. Aquest és, per tant, el primer exemple en una espècie vegetal diferent d'Arabidopsis thaliana que indica que el mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE/HSL2 es conserva en les angiospermes.

[EN] Abscission is an active, organized and highly coordinated cell separation process that enables the detachment of entire vegetative and reproductive organs, through the modification of cell-to-cell adhesion and breakdown of cell walls at specific sites on the plant body, known as abscission zones. In Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), abscission of floral organs and cauline leaves is regulated by the interaction of the hormonal peptide (IDA), a pair of redundant receptorlike protein kinases, (HAE and HSL2), and SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE co-receptors.

Knowledge about the molecular machinery regulating abscission in economically important plant species of the Solanaceae family is currently scarce. In this PhD research, a functional analysis of the components of the abscission signaling module IDA-HAE in N. benthamiana was carried out. In the first section of this work, the degree of conservation and the phylogeny of the IDA-like and HAE-like gene families in relevant species of the genus Solanum, Capsicumand Nicotiana were determined.

The expression of these genes in the allopolyploid N. benthamiana was analyzed, in order to identify members involved in abscission and in the response to abiotic stress conditions, such as drought. In the second section, the effect of the silencing and overexpression of NbenIDA1A and NbenIDA1B, two N. benthamiana IDA-like homeologs, which were associated with corolla abscission in the previous section, was evaluated. Furthermore, the effect on corolla abscission of the silencing of NbenHAE.1 was also determined.

The phylogenetic relationships among the IDA-like members of the Solanaceae studied, grouped the two pairs of NbenIDA1 and NbenIDA2 protein homeologs with the Arabidopsis prepropeptides related to abscission. Analysis of promoter regions searching for regulatory elements showed that these two pairs of homeologs contained both hormonal and drought response elements, although NbenIDA2A lacked the hormonal regulatory elements.

Gene expression analyses also indicate that the pair of NbenIDA1 homeologs are upregulated during corolla abscission. NbenIDA1 and NbenIDA2 pairs showed tissue differential expression under water stress conditions, since NbenIDA1 homeologs were highly expressed in stressed leaves, while NbenIDA2 homeologs, especially NbenIDA2B, were highly expressed in stressed roots. In non-stressed active growing plants, nodes and internodes were the tissues with the highest expression levels of all members of the IDA-like family and their putative HAE-like receptors.

VIGS-based silencing of the pair of NibenIDA1 homeologs and NbenHAE.1 suppressed corolla abscission in flowers of N. benthamiana, which was supported by a blockage in cell wall disassembly at the corolla base, probably due to the lack of upregulation of abscission-related hydrolytic enzymes. Ectopic over-expression of the homeolog NbenIDA1A advanced the timing of both corolla senescence and abscission and negatively affected the growth of N. benthamiana plants.

The results obtained using the VIGS approach showed that the pair of NbenIDA1 homeologs and the NbenHAE.1 receptor, possibly acting as a signaling module similar to that described in Arabidopsis, regulate corolla abscission in N. benthamiana flowers. This is therefore the first example in a plant species other than Arabidopsis thaliana that indicates that the IDA-HAE/HSL2 abscission signaling module is conserved in angiosperms.