Validación de nuevos biomarcadores no invasivos para el cáncer renal: DNA libre circulante en orina

Abstract

[ES] El cáncer se posiciona como una de las principales causas de muerte a nivel mundial, siendo el cáncer de células renales (CCR) el 8º más frecuente en países desarrollados. A pesar de la mejora en el diagnóstico y manejo, el CCR sigue presentándose como una de las neoplasias urológicas malignas más letales. La falta de biomarcadores no invasivos que representen la heterogeneidad del tumor hace que las líneas de actuación actuales no se utilicen de manera extendida y no sean suficientes para aumentar las tasas de supervivencia. La biopsia líquida y en concreto la orina, es una fuente de biomarcadores de fácil y económica obtención que reúne estas características.

En cánceres urológicos, la orina es el biofluido que está en contacto con las células tumorales. En ella, se encuentra el DNA libre circulante (cell-free DNA ¿ cfDNA), que proviene de células no tumorales que mueren principalmente por apoptosis y de células tumorales por necrosis. En la apoptosis se produce una mayor fragmentación del DNA por ser una muerte celular programada, mientras que en el ambiente tumoral la necrosis da lugar a una menor fragmentación. Este diferente grado de fragmentación del DNA da lugar a fragmentos de distintos tamaños que podría emplearse como biomarcador tumoral.

Por tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la integridad del cfDNA en orina como biomarcador en CCR. Para ello se empleó una colección de muestras de orina de 57 pacientes con CCR de los tres subtipos principales (38 de células claras, 14 papilares y 5 cromófobos) y 27 controles sanos. De cada paciente se recogieron dos muestras, una previa a la cirugía y otra posterior (entre 1 y 2 años después) mientras que de los controles una única muestra. Tras el aislamiento del cfDNA a partir de orina, se cuantificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real el nivel de expresión de un fragmento corto (potencialmente resultante de la apoptosis) y uno largo (potencialmente procedente de la necrosis) de los genes ACTB, AR, BCAS1, MYC y STOX1. Se calculó el ratio de fragmentos largos y cortos como medida de la integridad del DNA y se evaluaron las diferencias entre los grupos clínicos.

Algunos de los biomarcadores estudiados mostraron potencial diagnóstico y de clasificación de CCR. La integridad de ACTB y AR y el fragmento corto de MYC y STOX1 podrían servir para diagnosticar CCR de células claras, mientras que para papilar y cromófobo podrían usarse el ratio ACTB y el fragmento corto MYC, respectivamente. Además, se ha observado que, con una probabilidad elevada, el fragmento corto de MYC podría predecir el riesgo de pertenecer a cada uno de los tres subtipos, el ratio ACTB el riesgo de CCR de células claras y papilar, y el ratio AR y el fragmento corto de STOX1 el de células claras. Los biomarcadores estudiados no mostraron utilidad para evaluar el seguimiento de los pacientes con CCR. Una vez confirmados y validados en una cohorte mayor de pacientes, estos biomarcadores podrían tener valor en la práctica clínica del CCR.

[EN] Cancer is one of the leading causes of death worldwide, with renal cell carcinoma (RCC) being the 8th most common cancer in developed countries. Despite improved diagnosis and management, RCC remains one of the most lethal urological malignancies. The absence of non-invasive biomarkers that represent the heterogeneity of the tumour results in the current approaches not being widely used and not being sufficient to increase survival rates. Liquid biopsy and specifically urine, is an easy and inexpensive source of biomarkers that fulfils these requirements.

In urological cancers, urine is the biofluid that is in contact with tumour cells. It contains cell free DNA (cfDNA), which comes from non-tumour cells that die mainly by apoptosis and from tumour cells that die mainly by necrosis. In apoptosis, greater DNA fragmentation takes place due to programmed cell death, whereas in the tumour environment, necrosis results in less fragmentation. Consequently, the different degree of DNA fragmentation that originates fragments of different sizes might be used as a tumor biomarker.

Hence, the aim of this project was to evaluate the integrity of cfDNA in urine as a biomarker for RCC. For this purpose, a collection of urine samples from 57 RCC patients with the three main subtypes (38 clear cell, 14 papillary and 5 chromophobe) and 27 healthy controls were used. Two samples were collected from each patient, one pre-surgery and one post-surgery (between 1-2 years later) and from the controls only one sample. After isolation of cfDNA from urine, the expression level of a short (potentially resulting from apoptosis) and a long (potentially resulting from necrosis) fragment of the ACTB, AR, BCAS1, MYC and STOX1 genes were quantified by real-time quantitative PCR (qPCR). The ratio of long to short fragments was calculated as a measure of DNA integrity and the differences between the clinic groups were evaluated.

Some of the biomarkers studied showed diagnostic and classification potential in RCC. ACTB and AR integrity and MYC and STOX1 short fragment could be used to diagnose clear cell RCC, whereas for papillary and chromophobe the ACTB ratio and MYC short fragment could be used, respectively. Furthermore, it has been observed that with high probability the MYC short fragment could predict the risk of belonging to each of the three subtypes, while the ACTB ratio the risk of clear cell and papillary RCC, and the AR ratio and the STOX1 short fragment the clear cell RCC. The biomarkers studied were not useful to evaluate the follow-up of RCC patients. Once confirmed and validated in a larger cohort of patients, these biomarkers could have value in RCC clinical practice.