Characterization of the activity and selectivity profile of the MCL1-BOK interaction inhibitors

Abstract

[ES] La familia de proteínas BCL2 (B-cell lymphoma 2) regula la permeabilización de la membrana mitocondrial externa (MOM) durante el proceso de muerte celular por apoptosis. Las proteínas BCL2 constituyen una familia de 25 miembros y se caracterizan por la presencia de dominios de homología BCL2 (dominios BH) y un dominio transmembrana (TMD) carboxilo-terminal, presente en la mayoría de sus miembros. De acuerdo con su papel en el proceso de muerte y el número de dominios BH se clasifican en tres grupos: las proteínas antiapoptóticas (BCL2, BCLxL, MCL1, etc.); las proteínas "sensoras" proapoptóticas BH3 only (BAD, BID, BIM, PUMA, NOXA, etc.); y las "ejecutoras" proapoptóticas (BAX, BAK y BOK). Entre ellas forman una compleja red de interacciones, citosólicas y en membrana, que regula el destino celular. Estas interacciones se dan tanto entre dominios BH como entre TMDs. En los procesos tumorales, los equilibrios de interacción entre estas proteínas se ven alterados, desencadenando la evasión de la muerte celular. Actualmente, existen fármacos "miméticos del dominio BH3" que liberan las proteínas proapotóticas BAX/BAK induciendo la muerte celular. Sin embargo, presentan limitaciones para su uso como mutaciones en el dominio de unión. Es por ello por lo que las interacciones entre los TMDs ofrecen nuevas dianas para el desarrollo de fármacos antitumorales. En concreto, cabe destacar la interacción de los TMD de MCL1 y BOK. Se ha visto que MCL1 está sobrexpresado en numerosos tumores. El inhibidor especifico de MCL1, solo o en combinación con otras terapias, ha dado buenos resultados en ensayos preclínicos en modelos de cáncer de mama. El grupo ha realizado un primer cribado de moléculas inhibidoras de la interacción MCL1-BOK (MBoINs). Se busca favorecer la liberación de la proteína proapopotótica BOK desencadenando así la muerte de las células tumorales. En este punto del proyecto, el grupo se dispone a caracterizar en profundidad dos de las drogas identificadas en el cribado. El objetivo del presente TFG es caracterizar la actividad proapoptótica de estas dos nuevas moléculas. Por un lado, se estudia la especificidad de estas moléculas en la interacción proteica empleando un sistema de fluorescencia de complementación bimolecular (BIFc). El grupo dispone de plásmidos que expresan el TMD de cada proteína BCL2 de interés fusionado con el amino-terminal o carboxi-terminal de la proteína fluorescente Venus. Cuando estas construcciones se expresan en células y dos TMDs interaccionan, se reconstituye la proteína Venus registrándose fluorescencia, permitiendo detectar alteraciones en la señal fluorescente en presencia de moléculas que interfieran en la interacción. Por otro lado, se realizan ensayos de dosis respuesta en distintas líneas celulares de cáncer de mama para determinar la eficacia y la concentración a la cual las moléculas son capaces de inducir un 50% de muerte (IC50). Finalmente, se realizan experimentos de silenciamiento para demostrar la especificidad de las moléculas por su diana. Los datos obtenidos en este estudio permitirán disponer del perfil de eficacia de cada una de las moléculas para su evaluación en posteriores ensayos in vivo.

[EN] The BCL2 (B-cell lymphoma 2) protein family controls the outer mitochondrial membrane (OMM) permeabilization during the cell death process by apoptosis. BCL2 proteins constitute a family of 25 members characterized by the BCL2 homology (BH) domains and a carboxyl-terminal transmembrane domain (TMD), present in almost all members. According to their function in the cell death process and the number of BH domains, these proteins are classified into three groups: the antiapoptotic proteins (BCL2, BCLxL, MCL1,etc.); the proapoptotic BH3-only ¿sensor¿ proteins (BAD, BID, BIM, PUMA, NOXA, etc.); and the proapoptotic ¿executor¿ proteins (BAX, BAK y BOK). These members form a complex network of interactions, both in cytosol and lipidic membrane that regulate cell fate. The interactions are between BH domains but also between TMDs. In tumour process, the alteration of the BCL2 proteins interactions contribute to the development of evasion mechanisms of cell death. In this context, several ¿BH3 mimetic¿ drugs have been developed. They bind antiapoptotic members and release proapoptotic proteins BAX/BAK inducing cell death. Despite the relevance of these drugs, there are several limitations to their use like mutations in the drug binding domain. Thus, TMDs interactions may become novel targets for the development of antitumoral drugs. Among described TMDs interactions, MCL1 and BOK interaction should be underlined. Overexpression of MCL1 has been identified in several tumours. The specific inhibitor of MCL1 has shown good results, alone or in combination with other therapies, in breast cancer models. The group performed a first high throughput screening searching for molecules able to disrupt MCL1-BOK interaction (MBoINs). The aim is to release the proapoptotic BOK protein from the interaction enhancing tumour cell death. At this moment, the group is characterizing in depth two positive drugs. The objective of this work is to characterize the proapoptotic activity of these molecules. First, bimolecular fluorescence complementation (BiFc) assays will be carried out to study the specificity of the compounds in other TMD protein interactions. The group have prepared plasmids to express the TMD BCL2 protein fused to the amino or carboxyl terminal of Venus fluorescence protein. These constructs will be cotransfected in HCT116 cell line. Once TMDs interact, Venus protein is reconstituted and fluorescence can be detected. Molecules able to disrupt the TMD protein interaction cause alterations in the fluorescence signal. Next, dose-response assays will be performed to determine drug efficacy and calculate the concentration capable to induce the 50% of death (IC50). A panel of breast cancer lines will be evaluated. Finally, silencing assays will be performed to demonstrate the target specificity. The obtained data will help to determine the efficacy profile of each of the tested molecules for their subsequent evaluation for in vivo assays.