Correlación fenotipo-genotipo de variantes frameshift causantes de distrofias hereditarias de la retina

Abstract

[EN] Hereditary retinal dystrophies are a group of retinal disorders associated with more than 280 genes, including the Cone-Rod Homebox (CRX) gene, which encodes a transcription factor that is key in the terminal regulation of photoreceptors. Hence, defects in this gene lead to an alteration in these cells and this triggers different clinical entities such as Leber's congenital amaurosis, retinitis pigmentosa and cone and rod dystrophy. A dominant negative effect has been described in relation to variants that alter the reading pattern of the protein. The pathogenic mechanism has been attributed mainly to a deregulation at the RNA level, which has an impact on the overexpression of the protein. So far, no clinical correlation based on transcript and protein levels has been made for this type of variant. Therefore, in this work we have evaluated the effect of different frameshift variants in CRX causing the different clinical phenotypes mentioned above. The different variants produce very different expression profiles at both the RNA and protein levels, and high expression levels cannot be correlated with more severe clinical manifestations, and vice versa. However, loss of specific domains of the CRX protein has been shown to regulate RNA and protein levels. In turn, some variants have been identified that, despite not modifying RNA levels, induce an overexpression of the protein. These results suggest that there is a new regulatory pathway at the protein level that could contribute to the pathogenesis related to these variants. We have further explored the possibility that the protein may be missing ubiquitination sites in the C-terminal region and that this explains the accumulation of the altered protein.

[ES] Se estudiará la asociación fenotípico-genotipo en la mutación del gen CRX en retinopatías. CRX es un factor de transcripción esencial en la expresión, diferenciación y supervivencia del gen de los fotorreceptores que regulan conos y bastones. Se han detectado dos tipos de mutaciones de esta proteína: las missense, que son de cambio de aminoácido localizadas principalmente en el dominio de unión a DNA, y las frameshift (las que estudiaremos) principalmente localizadas en el dominio de transactivación. El interés de estas últimas se encuentra en la producción de una alteración en la expresión de CRX a nivel de RNA y de proteína. Ha sido demostrado que el mecanismo de patogénesis responde a un efecto dominante negativo. Además, dado que producen un cambio de pauta, podemos clasificarlas en diversos grupos en función de si comparten o no la misma pauta de lectura. En base a esto, se han descrito casos donde mutaciones distintas que producen la misma pauta de lectura pueden ocasionar clínicas con distinta severidad, produciendo diversas distrofias hereditarias de la retina: Amaurosis congénita de Leber, retinitis pigmentaria y distrofia en conos y bastones. Por tanto, el objetivo principal de este trabajo es, a partir de casos clínicos descritos, hacer un estudio comparativo entre la severidad de la enfermedad, la localización de la mutación y la expresión a nivel de RNA y proteína. De esta manera, pretenderemos identificar una correlación entre la longitud de la nueva secuencia de aminoácidos en C-terminal de la proteína mutada y el fenotipo clínico. Para llevar a cabo este objetivo, hemos seleccionado siete mutaciones diferentes en la proteína, en base a si existe clínica disponible: p.G122Afs*65, p.P145Lfs*42, p.G148Afs*39, p.P172Lfs*15, p.V180Gfs*56, p.P197Rfs*22 y p.Y221Tfs*9. En nuestro laboratorio se dispone de un plásmido que contiene la secuencia de CRX silvestre fusionada a EGFP en N-terminal. En primer lugar, mediante mutagénesis dirigida, empleando un kit comercial, obtendremos los diferentes clones que contiene las variantes seleccionadas, las cuáles serán validadas mediante secuenciación Sanger. A continuación, estos clones serán amplificados en bacterias para posteriormente purificarlos mediante kits de alta pureza. Posteriormente, las preparaciones de plásmidos puros se emplearán para transfectar células HEK293 mediante lipofectamina. Tras 24 horas de transfección, por un lado, las muestras serán recogidas para extracción de RNA y qRT-PCR, y, por otro lado, se analizará la expresión de la proteína por citometría de flujo a partir de los niveles de expresión de EGFP. Además de esto, por último, realizaremos montajes de células fijadas y teñidas con DAPI para estudiar la localización de la proteína y analizar los niveles de expresión.