Identificación de mutantes y genes que proporcionen tolerancia a estrés ácido intracelular

Abstract

[ EN ] Plants are immobile organisms that live in changing environments therefore have developed mechanisms to respond to all kinds of stresses including intracellular acid stress. PH homeostasis allows plant cells to maintain a pH within a narrow range in the different compartments, so the pH will be different depending on the location on the ground. This work is divided into two parts: first identification of new tolerant mutants during seedling establishment to acetic acid, and secondly determining the insertion point of T‐DNA by plasmid rescue mutants previously identified in Ramón Serrano laboratory. In the first part of the project about 11,000 Arabidopsis thaliana mutant lines FOX collection were employed, with about 88000 seeds, in a basal medium supplemented with 6 mM acetic acid was made. In this primary screen were obtained 132 tolerant mutants during germination, which after giving seeds in the greenhouse were analyzed using a secondary screen that confirmed only three mutants. As for the second part of the work, we attempted to locate the insertion point of the T‐DNA in 4 Somerville collection muntant lines obtained in the laboratory in previous scans. We could identify the insertion and orientation of the T‐DNA in 3 of them by the technique of plasmid rescue. It was also determined that both the E. coli strain XL1‐Blue MRF 'and the strain DH5α it can be used in these experiments. These results obtained may be used for investigation of the different pathways which possess plant to maintain intracellular pH during different abiotic stress conditions.

[ES] Las plantas son organismos inmóviles que habitan en ambientes cambiantes, por tanto han desarrollado mecanismos de respuesta a todo tipo de estreses entre ellos el estrés ácido intracelular. La homeostasis de pH permite a las células vegetales mantener un valor de pH dentro de un estrecho rango en los diferentes compartimentos, por tanto el pH será diferente según la localización en la planta. Este trabajo se ha dividido en dos partes: por un lado identificación de nuevos mutantes tolerantes a ácido acético durante el establecimiento de plántula, y por otro lado determinación de la zona de inserción del T‐DNA mediante rescate plasmídico en mutantes previamente identificados en el laboratorio del profesor Ramón Serrano. En el primer apartado del proyecto se emplearon cerca de 11000 líneas mutantes de Arabidopsis thaliana de la colección FOX, para ello se realizó un rastreo con aproximadamente 88000 semillas en un medio basal suplementado con 6 mM de ácido acético. En este rastreo primario se obtuvieron 132 de mutantes tolerantes durante la germinación, que tras dar semillas en el invernadero se volvieron a analizar mediante un rastreo secundario confirmándose solamente tres mutantes. En cuanto a la segunda parte del trabajo, se intentó localizar el punto de inserción del T‐DNA en 4 líneas mutantes de la colección de Somerville obtenidas en el laboratorio en rastreos previos. Se pudo identificar la zona de inserción, así como la orientación del T‐DNA, en 3 de ellas mediante la técnica del rescate plasmídico. Se determinó también, que tanto la cepa de E. coli XL1‐Blue MRF´ como la cepa DH5αpueden ser utilizadas en estos experimentos. Teniendo en cuenta que el T‐DNA tiene cuatro copias del activador transcripcional 35S y que el alcance de estos es de unas 10000 pares de bases, se determinaron los posibles genes que podrían verse involucrados en la resistencia al estrés ácido intracelular en los mutantes estudiados.