Caracterización del fenotipo metabólico de plantas transgénicas NagI. Estudio del patrón de expresión del posible gen de tomate S5H

Abstract

[CA] Com a mecanisme de defensa davant la gran varietat d'agressions exògenes, tant de naturalesa biòtica com abiòtica, les plantes han desenvolupat estratègies defensives molt efectives enfront de cada tipus d'estrés. Després de la interacció planta-patogen, es posa en marxa un sistema de comunicació molecular entre ambdós, que desencadena la inducció de mecanismes de defensa en la planta (Desender et al., 2007). D'entre aquestes molècules senyal que participen en l'activació de les defenses induibles, en aquest Treball Fi de Grau s'aborda l'estudi de l'àcid salicílic (SA) i del gentísic (GA) com a components clau d'interaccions incompatibles i compatibles, respectivament. Per a determinar el paper senyalitzador d'aquests metabolits, ha sigut crucial l'obtenció de plantes transgèniques NahG i NagI, incapaços d'acumular SA i GA, respectivament, com a resposta a la infecció. D'aquesta manera, les plantes NahG són més susceptibles a patògens en interaccions de tipus incompatible, mentre que les NagI podrien resultar ser-ho en interaccions de tipus compatible. L'objectiu central del present TFG és la caracterització del fenotip metabòlic de les plantes transgèniques NagI i l'estudi del patró d'expressió del possible gen de tomaca SA 5-hidroxilasa (S5H), proposat com a responsable de la transformació de SA a GA. Per això es van dur a terme tractaments exògens amb GA i SA, així com amb dos dels seus precursors (àcid benzoic i àcid o-cumàric) en plantes de tomaca MoneyMaker i plantes transgèniques NahG i NagI i es va estudiar la susceptibilitat de les plantes als mateixos. Posteriorment, es va dur a terme un estudi de l'acumulació de SA i GA en aquestes plantes com a conseqüència de l'aplicació exògena dels metabolits mencionats. Ademés, es van analitzar plantes de tomaca MoneyMaker infectades amb el Viroide de l'Exocortis dels Cítrics (CEVd) i la bacteria Pseudomonas syringae pv tomato amb la finalitat de verificar si l'ortòleg del gen S3H d'Arabidopsis thaliana identificat en tomaca, presenta nivells d'expressió majors en aquestes interaccions planta-patogen on té lloc l'acumulació de GA, respecte al control. Finalment, es va estudiar l'expressió diferencial del gen en estudi en les distintes línies transgèniques NahG i NagI sotmeses a tractaments exògens amb SA, GA, BA i o-CU. Els nostres resultats indiquen que les plantes transgèniques NahG i NagI acumulen menors nivells de SA i GA, la qual cosa explicaria la seua menor susceptibilitat als tractaments exògens aplicats que el seu fons genètic MoneyMaker. D'altra banda, l'ortòleg en tomaca del gen S3H d'Arabidopsis thaliana va presentar nivells d'expressió majors tant en les infeccions que produïxen l'acumulació de GA, com en plantes NagI sotmeses a estos tractaments, indicant així la seua possible activitat salicilat 5-hidroxilasa (S5H).

[ES ]Como mecanismo de defensa ante la gran variedad de agresiones exógenas, tanto de naturaleza biótica como abiótica, las plantas han desarrollado estrategias defensivas muy eficaces frente a cada tipo de estrés. Tras la interacción planta-patógeno, se pone en marcha un sistema de comunicación molecular entre ambos, que desencadena la inducción de mecanismos de defensa en la planta (Desender et al., 2007). De entre estas moléculas señal que participan en la activación de las defensas inducibles, en este Trabajo Fin de Grado se aborda el estudio del ácido salicílico (SA) y del gentísico (GA) como componentes clave de interacciones incompatibles y compatibles respectivamente. Para determinar el papel señalizador de estos metabolitos, ha sido crucial la obtención de plantas transgénicas NahG y NagI, incapaces de acumular SA y Ga, respectivamente, como respuesta a la infección. De este modo, las plantas NahG son más susceptibles a patógenos en interacciones de tipo incompatible, mientras que las NagI podrían resultar serlo en interacciones de tipo compatible. El objetivo central del presente TFG es la caracterización del fenotipo metabólico de plantas transgénicas NagI y el estudio del patrón de expresión del posible gen de tomate SA 5-hidroxilasa (S5H), propuesto como responsable de la transformación de SA a GA. Para ello, se llevaron a cabo tratamientos exógenos con GA y SA, así como con dos de sus precursores (ácido benzoico y ácido o-cumárico) de plantas de tomate MoneyMaker y plantas transgénicas NahG y NagI y se estudió la susceptibilidad de las plantas a los mismos. Posteriormente, se llevó a cabo un estudio de la acumulación de SA y GA en dichas plantas como consecuencia de la aplicación exógena de los metabolitos mencionados. Además, se analizaron plantas de tomate MoneyMaker infectada con el Viroide de la Exocortis de los Cítricos (CEVd) y la bacteria Pseudomonas syringae pv tomato con la finalidad de verificar si el ortólogo del gen S3H de Arabidopsis thaliana identificado en tomate, presenta niveles de expresión mayores en estas interacciones planta-patógeno donde tiene lugar la acumulación de GA, respecto al control. Por último, se estudió la expresión diferencial de dicho gen en las distintas líneas transgénicas NahG y NagI, sometidas a tratamientos exógenos con SA, GA, BA y o-CU. Nuestros resultados indican que las plantas transgénicas NahG y NagI acumulan menores niveles de SA y GA, lo que explicaría su menor susceptibilidad a los tratamientos exógenos aplicados que su fondo genético MoneyMaker. Por otra parte, el ortólogo en tomate del gen S3H de Arabidopsis thaliana presentó niveles de expresión mayores tanto en las infecciones que producen la acumulación de GA, como en plantas NagI sometidas a estos tratamientos, indicando así su posible actividad salicilato 5-hidroxilasa.

[EN] As a defense mechanism against the wide variety of exogenous aggressions, both biotic and abiotic nature, plants have developed highly effective defense strategies against each type of stress. After the plant-pathogen interaction, it is started a molecular communication system between them, which triggers the induction of defense mechanisms in the plant (Desender et al., 2007). Of these signal molecules involved in the activation of inducible defenses, in this Final Degree Proyect, salicylic acid (SA) and gentisic (GA) are studied as key components of incompatible and compatible interactions, respectively. To determine the signalling role of these metabolites, obtaining NahG and NagI transgenic plants, unable to accumulate SA and GA, respectively, in response to the infection, was crucial. Thus, NahG plants are more susceptible to pathogens that develop incompatible interactions, while NagI plants could be more susceptible to pathogen attacks in compatible interactions. The main objective of this TFG is the characterization of the metabolic phenotype of NagI transgenic plants and to study the pattern of expression of the possible gene of tomato SA 5-hydroxylase (S5H), proposed as responsible for the transformation of SA to GA. For that purpose, exogenous treatments with GA and SA were performed, as well as with two of their precursors (benzoic acid and o-coumaric acid), in MoneyMaker tomato plants and NahG and NagI transgenic plants and susceptibility of plants to them are studied. Subsequently, we carried out a study of the accumulation of SA and GA in such plants due to the exogenous application of these metabolites. In addition, MoneyMaker tomato plants infected with the Citrus Exocortis Viroid (CEVd) and the Pseudomonas syringae pv tomato bacterium were analyzed in order to verify if the ortholog of S3H gene of Arabidopsis thaliana, identified in tomato, has levels of expression greater than control plants in plant-pathogen interactions in which the accumulation of GA takes place. Finally, the differential expression of this gene was studied in different NagI and NahG transgenic lines under exogenous treatments with SA, GA, BA and o-CU. Our results indicate that NahG and NagI transgenic plants accumulate lower levels of SA and GA, which may explain the lower susceptibility to exogenous treatments applied to their genetic background MoneyMaker. Moreover, the tomato ortholog of the Arabidopsis thaliana gene S3H presented higher levels of expression in infections that cause the accumulation of GA, and in NagI plants subjected to these treatments, thus indicating a possible salicylate 5-hydroxylase (S5H) activity.